黑曲霉產(chǎn)糖化酶黑箱模型的構(gòu)建和應(yīng)用

李連偉，魯洪中，夏建業(yè)，儲炬，莊英萍，張嗣良

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黑曲霉產(chǎn)糖化酶黑箱模型的構(gòu)建和應(yīng)用

李連偉，魯洪中，夏建業(yè)，儲炬，莊英萍，張嗣良

華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237

李連偉, 魯洪中, 夏建業(yè), 等. 黑曲霉產(chǎn)糖化酶黑箱模型的構(gòu)建和應(yīng)用. 生物工程學(xué)報, 2015, 31(7): 1089–1098.Li LW, Lu HZ, Xia JY, et al. Construction and application of black-box model for glucoamylase production by Aspergillus niger. Chin J Biotech, 2015, 31(7): 1089–1098.

利用碳限制恒化實(shí)驗(yàn)研究了黑曲霉生長和糖化酶生產(chǎn)之間的相關(guān)性，結(jié)果表明當(dāng)比生長速率低于0.068 h–1時，菌體生長與產(chǎn)酶是相關(guān)的，當(dāng)比生長速率大于0.068 h–1時，菌體生長與產(chǎn)酶不相關(guān)。根據(jù)恒化實(shí)驗(yàn)結(jié)果獲得黑曲霉葡萄糖底物消耗的Monod動力學(xué)模型，并結(jié)合葡萄糖和氧消耗的Herbert-Pirt方程和產(chǎn)物形成的Luedeking-Piret方程構(gòu)建黑曲霉產(chǎn)糖化酶的黑箱模型。應(yīng)用該模型設(shè)計指數(shù)補(bǔ)料分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)控制菌體比生長速率在0.05 h–1，使糖化酶的得率最高達(dá)到0.127 g糖化酶/g葡萄糖，并成功地使用模型描述了黑曲霉產(chǎn)糖化酶的發(fā)酵過程。實(shí)驗(yàn)值和模擬值進(jìn)行比較表現(xiàn)出很好的適用性，表明黑箱模型可以用于指導(dǎo)黑曲霉產(chǎn)糖化酶發(fā)酵過程的設(shè)計和優(yōu)化。

黑曲霉，糖化酶，黑箱模型，指數(shù)補(bǔ)料分批發(fā)酵

糖化酶是一種由微生物分泌的具有外切酶活性的胞外酶。作為一種酸性蛋白酶，主要功能是從多聚糖 (例如淀粉) 的非還原性末端水解釋放β-D-葡萄糖[1]。糖化酶主要應(yīng)用于食品、制藥、發(fā)酵等工業(yè)[2]。黑曲霉由于高效的蛋白分泌能力廣泛應(yīng)用于糖化酶的工業(yè)生產(chǎn)，產(chǎn)量達(dá)20 g/L以上[3-4]。為進(jìn)一步提高糖化酶產(chǎn)量，發(fā)酵過程的優(yōu)化和設(shè)計對于提高糖化酶的生產(chǎn)是十分必要的。

對于微生物產(chǎn)酶發(fā)酵過程首先是要了解菌體生長與產(chǎn)酶之間的關(guān)系，關(guān)于黑曲霉生長與產(chǎn)酶之間的相關(guān)性的研究已有大量報道。Schrickx等[5]研究了不同黑曲霉菌株在以葡萄糖和麥芽糊精為底物時菌體生長與產(chǎn)酶的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)糖化酶生產(chǎn)與菌體生長相關(guān)，而且在以麥芽糊精為底物時，當(dāng)菌體比生長速率大于0.15 h–1，比產(chǎn)物形成速率不再隨比生長速率的增加而增加。Metwally等[6]的研究也表明以麥芽糖為底物、比生長速率在0.046–0.2 h–1范圍內(nèi)時，糖化酶的生成與菌體生長相關(guān)；而Pedersen等[7]的研究結(jié)果表明在高比生長速率條件下，產(chǎn)酶與菌體生長不相關(guān)。

相對于單純的發(fā)酵過程優(yōu)化，構(gòu)建數(shù)學(xué)模型更有利于深化對黑曲霉產(chǎn)糖化酶發(fā)酵過程的認(rèn)識[8]。關(guān)于絲狀菌產(chǎn)酶的數(shù)學(xué)模型已有大量的報道。Wang的模型描述了重組黑曲霉生產(chǎn)蛋白酶的發(fā)酵過程[9]。Albaek等[10]成功地模擬了不同通氣和攪拌下米曲霉發(fā)酵過程中菌體的生長、底物的消耗和酶的生成。Ma等[11]構(gòu)建了里氏木霉生產(chǎn)纖維素酶的模型并用于設(shè)計補(bǔ)料策略使酶產(chǎn)率增加了82.31%。根據(jù)我們了解，到目前還沒有關(guān)于黑曲霉生產(chǎn)糖化酶非結(jié)構(gòu)模型的報道。

本文通過碳限制恒化實(shí)驗(yàn)研究了不同比生長速率下黑曲霉生長與糖化酶形成的關(guān)系。構(gòu)建了黑曲霉產(chǎn)糖化酶發(fā)酵的黑箱模型，黑箱模型表明糖化酶的比形成速率與黑曲霉的比生長速率滿足Luedeking-Piret方程。我們使用黑箱模型設(shè)計補(bǔ)料分批實(shí)驗(yàn)，使糖化酶的得率最高，并成功地使用模型描述了黑曲霉產(chǎn)糖化酶的發(fā)酵過程。

1 模型

1.1 反應(yīng)方程

1.2 黑箱模型

菌體生長與產(chǎn)酶之間的關(guān)系可以用Luedeking- Piret模型來表示[13]。根據(jù)Luedeking-Piret模型可以將菌體生長與酶的生產(chǎn)分為生長相關(guān)型、部分生長相關(guān)型、生長不相關(guān)。根據(jù)黑曲霉產(chǎn)糖化酶的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)在一定比生長速率范圍內(nèi)產(chǎn)酶是生長相關(guān)的，而在高比生長速率下與生長不再相關(guān)。因此，在本文的研究中也使用Luedeking-Piret模型 (方程4) 來描述菌體生長與產(chǎn)酶的關(guān)系。

1.3 補(bǔ)料分批培養(yǎng)數(shù)學(xué)模型

使用黑箱模型設(shè)計補(bǔ)料分批實(shí)驗(yàn)，結(jié)合數(shù)學(xué)模型驗(yàn)證獲得黑箱模型的準(zhǔn)確性。發(fā)酵過程中發(fā)酵液質(zhì)量M (單位kg)、生物量X (單位g)、底物量S (單位g)、產(chǎn)物量P (單位g) 的變化可以使用方程7–10描述[10]。

1.4 模型的求解和模擬

使用OriginPro 9.0軟件擬合恒化培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)獲得黑箱模型參數(shù)。補(bǔ)料分批培養(yǎng)模擬使用MATLAB, version 2009b，微分方程求解使用ode45求解器。

2 材料與方法

2.1 菌株和培養(yǎng)基

黑曲霉菌株GAM15由荷蘭皇家帝斯曼集團(tuán) (DSM) 提供，是一株糖化酶生產(chǎn)的突變株。

種子培養(yǎng)基包含：22 g/L一水葡萄糖和20 g/L固體玉米漿。分批培養(yǎng)使用合成培養(yǎng)基包含：10 g/L一水葡萄糖，3 g/L (NH4)2SO4，3 g/L KH2PO4，0.02 g/L ZnCl2，1.69 g/L KH2PO4·2H2O，0.67 g/L EDTA，1.0 g/L MgSO4·7H2O，0.076 g/L CaCl2，0.015 g/L CuSO4·5H2O，0.015 g/L CoCl2·6H2O，0.04 g/L MnSO4·4H2O，0.3 g/L FeSO4·7H2O和 1 mL/L消泡劑。恒化培養(yǎng)的培養(yǎng)基與分批培養(yǎng)培養(yǎng)基基本一致，只是一水葡萄糖變?yōu)?.35 g/L，(NH4)2SO4變?yōu)?.5 g/L。培養(yǎng)基采用高溫滅菌，葡萄糖單獨(dú)滅菌并在無菌條件下加入到培養(yǎng)基中。

指數(shù)補(bǔ)料分批培養(yǎng)過程中，分批培養(yǎng)使用合成培養(yǎng)基包含：13.2 g/L一水葡萄糖，3 g/L (NH4)2SO4，3 g/L KH2PO4，0.02 g/L ZnCl2， 1.69 g/L KH2PO4·2H2O，0.67 g/L EDTA，1.0 g/L MgSO4·7H2O，0.076 g/L CaCl2，0.015 g/L CuSO4·5H2O，0.015 g/L CoCl2·6H2O，0.04 g/L MnSO4·4H2O，0.3 g/L FeSO4·7H2O 和1 mL/L 消泡劑。補(bǔ)料培養(yǎng)基與分批培養(yǎng)培養(yǎng)基基本一致，只是一水葡萄糖變?yōu)?20 g/L。培養(yǎng)基采用高溫滅菌，葡萄糖單獨(dú)滅菌并在無菌條件下加入到培養(yǎng)基中。

2.2 培養(yǎng)條件

種子培養(yǎng)使用帶擋板的搖瓶，包含100 mL種子培養(yǎng)基，107孢子/mL孢子懸液接種1 mL，起始培養(yǎng)基pH維持在6.5，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，種子培養(yǎng)24 h。

碳限制恒化實(shí)驗(yàn)使用5 L發(fā)酵罐 (上海國強(qiáng)生化工程裝備公司)，通過控制恒定液面方法控制發(fā)酵液體積控制在3 L，使用3 mol/L NaOH控制pH 4.5，通氣量3 L/min，攪拌轉(zhuǎn)速375 r/min (2平葉槳)，溫度控制 (34±0.1) ℃。當(dāng)分批培養(yǎng)葡萄糖耗盡和溶氧上升時，由分批培養(yǎng)轉(zhuǎn)為恒化培養(yǎng)。當(dāng)發(fā)酵液完成5個洗脫體積，二氧化碳生成速率、酶濃度、菌濃保持恒定時恒化培養(yǎng)達(dá)到穩(wěn)態(tài)。

指數(shù)補(bǔ)料分批實(shí)驗(yàn)使用5 L發(fā)酵罐 (上海國強(qiáng)生化工程裝備公司)，初始發(fā)酵液體積為3 L，使用氨水控制pH 4.5，通氣量3 L/min，攪拌轉(zhuǎn)速375?525 r/min (2平葉槳)，溫度控制(34±0.1) ℃。

2.3 分析方法

2.3.1 酶活測定

酶活使用淀粉葡萄糖苷酶(AGI) 表示。一個AGI單位定義為在pH 4.3和溫度60 ℃條件下每分鐘從可溶性淀粉水解生成1 μmol葡萄糖所需的酶量。50 mg糖化酶標(biāo)品對應(yīng)大約2 500 AGI。糖化酶酶活測量：230 μL p-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(AGIsub) 試劑(37 ℃預(yù)熱5 min) 與20 μL發(fā)酵液上清混合，37 ℃反應(yīng)20 min后加100 μL AGIstop試劑，在405 nm下測量混合液體吸光度來定量糖化酶。

2.3.2 菌濃測定

采用抽濾方法使用孔徑0.8 μm的玻璃纖維濾膜過濾菌體，使用50 mL去離子水洗滌菌體，70 ℃干燥24 h稱量濾膜重量。

2.3.3 葡萄糖測定

恒化穩(wěn)態(tài)下葡萄糖濃度測定使用Dionex ICS 3000 (Dionex，Sunnyvale，CA) 離子色譜。分離柱Carbopac PA 200，柱溫30 ℃，流動相3 mmol/L NaOH，流速0.35 mL/min，檢測器電化學(xué)檢測器(ED40)。

2.3.4 尾氣測定

發(fā)酵過程中，氧氣的消耗速率和二氧化碳的生成速率使用過程質(zhì)譜儀(MAX300-LG，Extrel) 測定。溶氧使用極譜溶氧電極(Mettler Toledo) 測定。

3 結(jié)果與分析

3.1 恒化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 Monod動力學(xué)模型

3.1.2 糖化酶形成與黑曲霉生長的關(guān)系

在葡萄糖限制恒化培養(yǎng)穩(wěn)態(tài)條件下，糖化酶的濃度隨比生長速率的增加而增加，并在μ=0.08 h–1時達(dá)到最大 (圖2A)。糖化酶濃度隨比生長速率的變化趨勢與Metwally的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似[16]。另外，實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)在比生長速率低于0.03 h–1時連續(xù)培養(yǎng)超過2個洗脫體積會出現(xiàn)發(fā)酵液的褐化現(xiàn)象，菌體的形態(tài)發(fā)生改變而且穩(wěn)態(tài)后的糖化酶濃度是褐化前的兩倍 (圖2A中的空心實(shí)驗(yàn)點(diǎn)數(shù)據(jù))，可能與菌體的突變和退化有關(guān)[17]。

圖1 黑曲霉葡萄糖限制恒化培養(yǎng)下比生長速率與葡萄糖濃度的關(guān)系

研究葡萄糖限制恒化培養(yǎng)條件下比產(chǎn)物形成速率與比生長速率的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，在0?0.068 h–1范圍內(nèi)比產(chǎn)物形成速率與比生長速率呈線性關(guān)系，糖化酶的形成與菌體的生長是相關(guān)的(圖2B)。當(dāng)比生長速率大于0.068 h–1時，比產(chǎn)物形成速率不再隨比生長速率的增加而增加，糖化酶的形成不依賴于菌體生長，而且在高比生長速率下糖化酶的形成受到抑制。在相關(guān)黑曲霉產(chǎn)糖化酶的研究中，Metwally等[5-6]在以麥芽糖為底物恒化培養(yǎng)條件下和Schrickx等[5-6]以葡萄糖為底物恒化培養(yǎng)條件下，發(fā)現(xiàn)比生長速率0.04?0.2 h–1范圍內(nèi)比糖化酶的形成速率與比生長速率是相關(guān)的，而Schrickx等[5-6]以麥芽糊精為底物恒化培養(yǎng)條件下也發(fā)現(xiàn)當(dāng)比生長速率大于0.15 h–1時，糖化酶形成與菌體的生長不相關(guān)。Pedersen等[7]在研究以葡萄糖和麥芽糖為底物的批培養(yǎng)、恒化培養(yǎng)和補(bǔ)料分批培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，在比生長速率0?0.1 h–1范圍內(nèi)比糖化酶形成速率線性增加，而在0.1?0.2 h–1范圍內(nèi)比糖化酶形成速率恒定。分析造成高比生長速率條件下比糖化酶形成速率不再增加的原因，可能是出現(xiàn)葡萄糖分解代謝物阻遏作用和在高比生長速率下更多能量用于菌體生長。

3.1.3 底物消耗Herbert-Pirt方程

3.1.4 氧消耗Herbert-Pirt方程

3.2 補(bǔ)料分批實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 設(shè)計補(bǔ)料策略

圖3 黑曲霉葡萄糖限制恒化培養(yǎng)下比葡萄糖消耗速率與比生長速率、比產(chǎn)物形成速率的關(guān)系

圖4 黑曲霉葡萄糖限制恒化培養(yǎng)下比氧消耗速率與比生長速率、比產(chǎn)物形成速率的關(guān)系

表1 葡萄糖限制恒化培養(yǎng)下黑曲霉黑箱模型參數(shù)

要控制補(bǔ)料分批發(fā)酵過程中菌體比生長速率恒定，補(bǔ)料過程中葡萄糖的補(bǔ)料曲線可以用方程 (11) 來表示。

3.2.2 指數(shù)補(bǔ)料分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

碳限制條件下指數(shù)補(bǔ)料分批發(fā)酵過程如圖5所示，整個發(fā)酵過程溶氧水平在20%以上，并未出現(xiàn)氧限制。在分批培養(yǎng)發(fā)酵結(jié)束溶氧開始上升時開始指數(shù)補(bǔ)料，指數(shù)補(bǔ)料發(fā)酵時間持續(xù)29 h。

圖5 指數(shù)補(bǔ)料分批培養(yǎng)下葡萄糖 (A)、生物量 (B)、糖化酶 (C) 和OUR (D)實(shí)驗(yàn)值與模擬值比較

實(shí)驗(yàn)值與模擬值比較見圖5，從圖5中可以看出黑箱模型可以很好地預(yù)測指數(shù)補(bǔ)料分批發(fā)酵過程中葡萄糖的消耗、菌體的形成、糖化酶的形成和氧的消耗。模型預(yù)測值和實(shí)驗(yàn)值相對誤差都在10%以內(nèi)，糖量模型預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值相對誤差平均為4.3%；菌量模型預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值相對誤差平均為9.5%；糖化酶量模型預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值相對誤差平均為9.7%；OUR模型預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值相對誤差平均為5.9%；菌量模擬預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)值相對誤差較大，分析主要原因是由于發(fā)酵過程后期生物量較高，黑曲霉出現(xiàn)掛壁現(xiàn)象，導(dǎo)致在發(fā)酵后期菌體實(shí)驗(yàn)值略低于模擬值。

通過計算發(fā)酵過程中相關(guān)得率數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)糖化酶基于菌體的得率實(shí)驗(yàn)值0.407 (g糖化酶/g菌體) 與模擬值得率0.403 (g糖化酶/g菌體) 十分接近，而且糖化酶基于葡萄糖的得率實(shí)驗(yàn)值0.127 (g糖化酶/g葡萄糖) 與模擬值最大得率0.134 (g糖化酶/g葡萄糖) 的相對誤差為5.5%。從指數(shù)補(bǔ)料分批發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，恒化實(shí)驗(yàn)獲得的黑箱模型可以用于設(shè)計黑曲霉產(chǎn)糖化酶的發(fā)酵過程。根據(jù)黑箱模型模擬結(jié)果，在較低的比生長速率下葡萄糖更多地用于維持菌體代謝，而在高比生長速率下，菌體的生長與糖化酶的形成存在競爭關(guān)系，葡萄糖優(yōu)先用于菌體的生長而抑制了糖化酶的形成，通過控制菌體在最適比生長速率使更多葡萄糖用于糖化酶的形成，可以實(shí)現(xiàn)糖化酶的得率最高。

4 結(jié)論

基于葡萄糖限制下恒化實(shí)驗(yàn)黑曲霉生長與糖化酶生產(chǎn)相關(guān)性的研究發(fā)現(xiàn)，在比生長速率低于0.068 h–1時糖化酶生產(chǎn)與菌體生長相關(guān)，而比生長速率高于0.068 h–1時糖化酶生產(chǎn)與菌體生長不相關(guān)。采用底物消耗Monod方程、Herbert-Pirt方程和Luedeking-Piret方程構(gòu)建的黑曲霉產(chǎn)糖化酶的黑箱模型能夠很好地描述發(fā)酵過程中底物消耗、菌體的生長、產(chǎn)物的形成。

相比于碳限制發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，氧限制更有利于黑曲霉產(chǎn)糖化酶發(fā)酵過程[18-20]。而基于碳限制的數(shù)學(xué)模型在黑曲霉產(chǎn)糖化酶補(bǔ)料分批發(fā)酵過程的成功應(yīng)用，對于氧限制條件下黑曲霉產(chǎn)糖化酶發(fā)酵過程的設(shè)計和優(yōu)化具有借鑒意義，并可以為發(fā)酵過程的進(jìn)一步放大提供指導(dǎo)。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Construction and application of black-box model for glucoamylase production by

Lianwei Li, Hongzhong Lu, Jianye Xia, Ju Chu, Yingping Zhuang, and Siliang Zhang

State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China

Carbon-limited continuous culture was used to study the relationship between the growth ofand the production of glucoamylase. The result showed that when the specific growth rate was lower than 0.068 h–1, the production of glucoamylase was growth-associated, when the specific growth rate was higher than 0.068 h–1, the production of glucoamylase was not growth-associated. Based on the result of continuous culture, the Monod dynamics model of glucose consumption ofwas constructed, Combining Herbert-Pirt equation of glucose and oxygen consumption with Luedeking-Piret equation of enzyme production, the black-box model offor enzyme production was established. The exponential fed-batch culture was designed to control the specific growth rate at 0.05 h–1by using this model and the highest yield for glucoamylase production byreached 0.127 g glucoamylase/g glucose. The black-box model constructed in this study successfully described the glucoamylase production byand the result of the model fitted the measured value well. The black-box model could guide the design and optimization of glucoamylase production by.

, glucoamylase, black-box model, exponential fed-batch culture

December 24, 2014;

March 17, 2015

National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2013CB733600), NWO-MoST Joint Program (No. 2013DFG32630).

Ju Chu. Tel: +86-21-64253021; E-mail: juchu@ecust.edu.cn

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃 (973計劃) (No. 2013CB733600)，中荷國際合作項目 (No. 2013DFG32630) 資助。

2015-05-13

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150513.1530.002.html