外源甜菜堿對匍匐翦股穎的抗旱性調控作用分析

劉思露，楊鵬，尹淑霞＊

（1.北京林業(yè)大學林學院草坪研究所，北京100083；2.內蒙古農業(yè)大學經濟管理學院，內蒙古 呼和浩特010019）

隨著世界范圍內的水資源短缺，干旱已經成為限制植物生長最主要的非生物脅迫因素之一［1－2］。在干旱脅迫下，植物生長受到抑制，細胞滲透調節(jié)能力下降，活性氧（reactive oxygen species，ROS）大量積累，嚴重時植株萎蔫甚至死亡［3－4］。為應對干旱脅迫，許多高等植物細胞內往往積累一些小分子有機化合物，甘氨酸甜菜堿（glycine betaine，GB）就是其中之一［5－6］。大量研究表明，植物在受到逆境脅迫時細胞內通過積累一定量的GB，以降低細胞滲透勢，維持細胞膨壓［7］，還能作為保護物質，維持植物細胞生物大分子的結構和完整性，并解除逆境脅迫對酶活性的毒害，清除活性氧的積累，保護呼吸酶和能量代謝，影響細胞內的離子分布［8］。近年來一些研究表明，不論外施GB還是通過基因工程促進GB在植物體內的積累，均可增強植物對干旱脅迫的抵抗能力［9－13］。目前對GB提高植物抗旱性的研究主要集中于經濟作物——如棉花（Gossypiumhirsutum）、煙草（Nicotianatabacum）等［12，14］，或糧食作物——如玉米（Zeamays）、小麥（Triticumaestivum）等［11，15］，而對于 GB在提高草坪草抗旱性方面的研究則鮮見報道。

匍匐翦股穎（Agrostisstolonifera）屬于禾本科翦股穎屬，是一種重要的冷季型草坪草，因其具有質地細密、結構良好、耐低修剪等優(yōu)良特性，在高爾夫球場果嶺、發(fā)球臺、球道等運動場草坪中廣泛應用。但因其耐旱性較弱，養(yǎng)護中需大量用水，干旱脅迫會嚴重影響草坪質量與使用壽命［16］?；贕B有提高植物抗旱性的作用以及高檔草坪耐旱性較弱的特點，本試驗研究了干旱脅迫及復水條件下不同濃度GB處理對匍匐翦股穎的生理影響，其目的為，1）探明外施GB提高匍匐翦股穎抗旱性的可能，2）探討GB調控匍匐翦股穎抗旱性的生理機理，3）初步探索GB作為草坪肥料在高檔草坪中應用的可能性。從而為提高草坪草對干旱脅迫的適應性以及節(jié)約球場和城市綠地用水提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以匍匐翦股穎（T－1）的成熟草皮為供試材料。草皮由北京林業(yè)大學草坪研究所昌平區(qū)試驗基地提供，于2013年5月中旬播種，期間正常養(yǎng)護管理。甘氨酸甜菜堿購買自北京科百奧公司。

1.2 試驗設計

2013年9月初，選取生長良好、長勢均一的供試草皮，從中切取16塊邊長15cm，厚度為5cm的方形草塊，分別移栽于直徑和深度均為16.5cm的盆缽中。所用土壤按照沙與土1∶2比例混合，供試土壤所含養(yǎng)分如下：全氮0.385g，有效磷10.9mg／kg，速效鉀61.0mg／kg，有機質5.70g／kg，全鹽0.24g／kg，pH 8.58。將盆缽放置在溫室中進行適應性生長，每周向每盆均勻施入等量的1／2Hoagland’s全營養(yǎng)液，修剪并維持草坪高度為5 cm左右。期間草坪無其他脅迫。

適應性生長50d后，進行GB預處理。GB設4個處理濃度：0，50，100，200mmol／L（G0、G50、G100、G200）。葉面噴施GB，噴施方法為用小型手持式噴霧劑在葉片正背兩面均勻噴施，以葉面濕潤不流滴為準，每盆施入20mL（G0施入等量蒸餾水）。每天下午17時進行一次處理，連續(xù)處理3d。最后一次處理3d后進行水分脅迫處理。設置土壤含水量5個水平，分別為：第0天80%～90%（D0），1～14d降至50%～60%（輕度干旱，D1），第15～21天降至40%～50%（中度干旱，D2），第22～28天降至30%～40%（嚴重干旱，D3），第29～35天恢復至80%～90%（復水處理，R）。每天用ML2x便攜式土壤水分測量儀對每組土壤水分進行監(jiān)測。通過自然蒸發(fā)的方式，當土壤水分蒸發(fā)降至設計的下限時，即進行灌水達到相應的上限含水量。水分處理的第0，14，21，28，35天（表示為D0、D1、D2、D3、R），剪取生長狀況基本一致的充分展開葉2～3g，其中相對含水量、電導率和葉綠素含量立即用鮮葉測量，余下樣品用液氮速凍并存于－80℃冰箱中，用于其他相關指標的測定，每處理4次重復。

1.3 測定指標與方法

坪觀質量（visual turf quality）采用 NTEP草坪外觀質量評價法測定［17］；相對含水量（relative water content，RWC）采用稱重法測定［18］；電導率（electrolyte leakage，EL）采用電導率儀測定［19］；葉綠素（chlorophyll）采用浸提比色法測定［20］；游離脯氨酸（free proline）采用茚三酮比色法測定［21］；可溶性蛋白（soluble protein）采用考馬斯亮藍法測定［22］；丙二醛（malondialdehyde，MDA）采用 Dhindsa等［23］的方法測定；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）采用Zhang和 Kirkham［24］的方法測定；過氧化氫酶（catalase，CAT）采用紫外吸收法測定［25］；過氧化物酶（peroxidase，POD）采用愈創(chuàng)木酚法測定［26］。

1.4 統(tǒng)計分析

采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)處理和繪圖；SPSS Statistics 19軟件進行方差分析和顯著性分析（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 外源甜菜堿對干旱脅迫及復水條件下匍匐翦股穎坪觀質量的影響

GB預處理3d后（D0），G200的坪觀質量（7.3分）顯著低于對照（7.7分）（P＜0.05），而G50和G100與對照基本一致（圖1）。隨著干旱程度的不斷加劇，對照坪觀質量呈下降趨勢，后期迅速降低，GB處理顯著降低了坪觀質量的下降幅度，并以100mmol／L濃度效果最為顯著。其中，輕度干旱時期（D1），對照與GB處理組差異不顯著；中度干旱（D2），G100比對照增加了48.57%并達差異顯著水平（P＜0.05）；至嚴重干旱（D3），G50、G100和 G200分別比對照增加45.45%，90.91%和63.64%，均達顯著差異（P＜0.05）。復水后（R），坪觀質量逐漸回升，GB處理組均顯著高于對照，并以G100效果最好。該結果表明，中低濃度GB能夠顯著提高干旱脅迫下匍匐翦股穎的坪觀質量，而高濃度GB可能會對匍匐翦股穎的正常生長產生不利影響。

2.2 外源甜菜堿對干旱脅迫及復水條件下匍匐翦股穎葉片相對含水量的影響

外源GB預處理后（D0），G50與G100處理的匍匐翦股穎葉片相對含水量分別維持在94.54%和85.47%，與對照（91.03%）相近，而G200（83.44%）處理顯著低于對照（P＜0.05）（圖2）。在干旱脅迫中，葉片相對含水量隨干旱時間的延長逐漸下降，后期迅速下降。干旱初期（D1，D2），對照與GB處理組差異不明顯；至嚴重干旱（D3），G100和G200分別較對照增加71.89%和60.00%（P＜0.05），G50效果不顯著。復水后（R），葉片相對含水量迅速上升，GB處理組均顯著高于對照，并以G100效果最好?？梢姡珿B處理能夠提高匍匐翦股穎葉片細胞的滲透調節(jié)能力，從而促進其保水性，但濃度過高可能會對正常生長條件下的匍匐翦股穎造成一定傷害。

2.3 外源甜菜堿對干旱脅迫及復水條件下匍匐翦股穎葉片細胞膜透性（電導率）的影響

如圖3所示，GB處理3d后（D0），與對照相比，G50、G100葉片電導率有所增加，而G200高于對照并達顯著水平（P＜0.05）。干旱脅迫期間，對照電導率持續(xù)升高，后期迅速升高，而GB處理增幅低于對照。干旱初期（D1，D2），對照和各GB處理差異不顯著；嚴重干旱（D3）時，與干旱前相比，對照葉片電導率增加3.76倍，G50、G100和G200分別增加了1.52，1.27和1.02倍。復水（R）后，對照葉片電導率繼續(xù)升高，但增幅有所降低，GB處理組則均出現(xiàn)下降，且顯著低于對照（P＜0.05）。該結果顯示，嚴重干旱可能會對細胞膜造成不可逆的破壞，而GB處理緩解并修復了這種傷害，降低了膜透性，同時進一步證明了高濃度GB可能會對匍匐翦股穎的正常生長造成滲透損傷。

2.4 外源甜菜堿對干旱脅迫及復水條件下匍匐翦股穎葉片葉綠素含量的影響

GB預處理3d后（D0），對照和GB處理后的葉片葉綠素含量基本無差異（圖4）。干旱脅迫過程中，對照組葉片葉綠素含量逐漸下降，不同濃度的GB處理能夠顯著提高匍匐翦股穎葉綠素含量。其中，G100和G200處理效果最明顯，干旱脅迫的3個時期均顯著高于對照（P＜0.05）。如輕度干旱（D1）時，G100較對照增加23.44%，G50和G200無顯著影響；中度干旱（D2）時，G100和G200比對照增加了31.03%和29.31%；G50影響不顯著；嚴重干旱（D3）時，對照降至最低，G50、G100和G200分別比對照增加14.29%，35.71%和28.57%。復水（R）后，各組葉綠素含量逐漸上升，G50和G100上升了17.54%左右為最高，其次為對照（16.67%）。

圖1 外源甜菜堿對干旱脅迫及復水條件下匍匐翦股穎坪觀質量的影響Fig.1 Effects of glycine betaine（GB）on visual turf quality of creeping bentgrass under drought stress and rehydration conditions

圖2 外源甜菜堿對干旱脅迫及復水條件下匍匐翦股穎葉片相對含水量的影響Fig.2 Effects of glycine betaine（GB）on leaf relative water content of creeping bentgrass under drought stress and rehydration conditions

圖3 外源甜菜堿對干旱脅迫及復水條件下匍匐翦股穎葉片電導率的影響Fig.3 Effects of glycine betaine（GB）on leaf electrolyte leakage of creeping bentgrass under drought stress and rehydration conditions

圖4 外源甜菜堿對干旱脅迫及復水條件下匍匐翦股穎葉片葉綠素含量的影響Fig.4 Effects of glycine betaine（GB）on leaf chlorophyll content of creeping bentgrass under drought stress and rehydration conditions

2.5 外源甜菜堿對干旱脅迫及復水條件下匍匐翦股穎葉片游離脯氨酸含量的影響

如圖5所示，噴施GB后（D0），處理組葉片游離脯氨酸含量高于對照且隨GB濃度的升高而增加。干旱期間，對照與GB處理組葉片脯氨酸含量呈增長趨勢。輕度干旱（D1）時，與對照相比，G50、G100和G200依次較對照增加了1.89，1.88和2.41倍；中度干旱（D2）時各組之間無顯著差異；至嚴重干旱（D3），處理組葉片脯氨酸含量大幅度提高，其中G50增至對照的2.13倍，G100和G200依次增加為對照的2.03和1.39倍，均達顯著差異（P＜0.05）。復水（R）后，脯氨酸含量逐漸降低，其中對照降幅度最低（11.67%），處理組隨GB濃度的升高依次降低了39.23%、36.94%和49.73%。說明匍匐翦股穎本身具有良好的滲透調節(jié)能力與自我修復能力。

2.6 外源甜菜堿對干旱脅迫及復水條件下匍匐翦股穎葉片可溶性蛋白含量的影響

如圖6，GB處理3d后（D0），處理組葉片可溶性蛋白含量隨處理濃度的提高依次增加為對照的2.65，2.71和1.62倍（P＜0.05）。說明GB誘導了大量蛋白質的合成與積累。干旱脅迫過程中，對照葉片可溶性蛋白含量呈逐漸上升趨勢；而GB處理后可溶性蛋白含量在干旱初期基本保持不變，當水分進一步虧缺至嚴重干旱（D3），G50比對照增加49.64%，G100和G200依次比對照增加了22.54%和21.58%。復水（R）后，各組可溶性蛋白含量逐漸降至干旱前的水平，其中對照降幅最低（34.53%）；G50降幅最高（47.92%），G100和G200降幅分別為39.53%和38.86%。

圖6 外源甜菜堿對干旱脅迫及復水條件下匍匐翦股穎葉片可溶性蛋白含量的影響Fig.6 Effects of glycine betaine（GB）on leaf soluble protein content of creeping bentgrass under drought stress and rehydration conditions

2.7 外源甜菜堿對干旱脅迫及復水條件下匍匐翦股穎葉片丙二醛含量的影響

GB處理3d后（D0），不同濃度處理的葉片MDA含量變化不大并與對照差異不顯著（圖7）。干旱脅迫開始后，與D0相比，對照葉片 MDA含量隨干旱程度的加劇依次增加了29.94%（D1）、68.18%（D2）和84.02%（D3），GB處理組增幅均小于對照并以G100最低（依次為8.52%、24.46%和40.00%），G50和G200效果次之，且在干旱后期才作用顯著。該結果表明，適宜的GB處理能降低干旱脅迫對匍匐翦股穎造成的膜脂過氧化強度。復水（R）后，各組葉片MDA含量迅速下降至干旱前的水平。其中，對照下降了34.27%，降幅最大，而GB處理組降幅較小。

2.8 外源甜菜堿對干旱脅迫及復水條件下匍匐翦股穎葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

如圖8所示，GB預處理3d后（D0），對照與GB處理組的匍匐翦股穎葉片SOD活性基本保持一致。干旱脅迫期間，對照葉片SOD活性呈增長趨勢，施加GB后增幅明顯提高。干旱初期以G100效果最明顯，輕度干旱（D1）和中度干旱（D2）時，G100處理SOD活性分別比對照增加了18.59%和31.25%；至嚴重干旱（D3）時，G50、G100和G200依次比對照增加11.01%，47.42%和6.47%，其中 G100與對照達差異顯著（P＜0.05）。復水后（R），各組SOD活性均有所降低，但依然高于干旱前的水平，且GB處理后的葉片SOD活性高于對照。

2.9 外源甜菜堿對干旱脅迫及復水條件下匍匐翦股穎葉片過氧化氫酶（CAT）活性的影響

噴施GB 3d后（D0），GB處理顯著提高了葉片 CAT活性（P＜0.05），G50，G100和 G200平均增加為對照的1.84，2.71和2.61倍（圖9）。干旱脅迫期間，葉片CAT活性呈增長趨勢，與對照相比GB處理組增幅較大，G50在各干旱時期（D1，D2，D3）依次比對照增加了0.48，0.70和0.32倍，而 G100處理依次增加了1.11，0.83和0.43倍，G200處理效果不明顯。復水（R）后，CAT活性出現(xiàn)不同程度的下降，GB處理組幾乎降至干旱前的水平，而對照降幅較低，且比干旱前增加了1.84倍。這進一步證明了匍匐翦股穎自身具備較強的抗氧化能力與自我調節(jié)能力，且復水過程使匍匐翦股穎積累了更多的抗旱性。

2.10 外源甜菜堿對干旱脅迫及復水條件下匍匐翦股穎葉片過氧化物酶（POD）活性的影響

如圖10所示，GB預處理后（D0），各組葉片POD活性幾乎無差別。干旱初期，各組POD活性緩慢增加，其中G100在輕度干旱（D1）時比對照增加34.91%（P＜0.05），其余各組與對照差異未達顯著。至嚴重干旱（D3）時期，各組POD活性均大幅度提高，但GB處理與對照差異不顯著。復水（R）后，各組POD活性有所降低但高于干旱前的水平，其中G50比對照增加14.6%，達顯著差異（P＜0.05）。

圖7 外源甜菜堿對干旱脅迫及復水條件下匍匐翦股穎葉片丙二醛含量的影響Fig.7 Effects of glycine betaine（GB）on leaf malondialdehyde content of creeping bentgrass under drought stress and rehydration conditions

圖8 外源甜菜堿對干旱脅迫及復水條件下匍匐翦股穎葉片SOD活性的影響Fig.8 Effects of glycine betaine（GB）on activities of superoxide dismutase（SOD）in leaves of creeping bentgrass under drought stress and rehydration conditions

圖9 外源甜菜堿對干旱脅迫及復水條件下匍匐翦股穎葉片CAT活性的影響Fig.9 Effects of glycine betaine（GB）on activities of catalase（CAT）in leaves of creeping bentgrass under drought stress and rehydration conditions

圖10 外源甜菜堿對干旱脅迫及復水條件下匍匐翦股穎葉片POD活性的影響Fig.10 Effects of glycine betaine（GB）on activities of peroxidase（POD）in leaves of creeping bentgrass under drought stress and rehydration conditions

3 討論

干旱降低了植物體內的水分平衡，進而影響植物體正常的生理生化功能。植物葉片相對含水量的變化可以直觀反映植物體內水分含量，因此相對含水量可作為植物遭受逆境脅迫傷害程度的指標［27］。草坪的坪觀質量可以直接反映草坪的生長狀況。本研究中，外源GB明顯緩解了匍匐翦股穎葉片相對含水量的下降，并在復水后使其快速上升并依然高于對照，這與坪觀質量的結果相一致。說明GB提高了植物細胞的滲透調節(jié)能力，減輕和修復葉片的受損，使匍匐翦股穎在復水后積累了更多對干旱逆境的防御能力，提高了匍匐翦股穎的抗旱能力。

葉綠素是植物光合作用過程中負責吸收和轉換光能的重要色素，干旱脅迫導致植物葉片失水，進而影響葉綠素的生物合成，并促進已合成的葉綠素分解［28］。本研究發(fā)現(xiàn)，GB處理能夠顯著提高干旱脅迫條件下匍匐翦股穎葉綠素含量。Kel等［2］在干旱及鹽脅迫條件下對番茄（Lycopersiconesculentum）葉面噴施GB也得到類似結果。研究認為，外施GB能夠保護和修復干旱脅迫對光系統(tǒng)II（PSII）的損傷［2，29］，提高葉綠素psbA基因的表達，加快受損光合蛋白D1的周轉［30］。也有研究認為，脫落酸、GB等內源激素的增加能夠阻止葉綠素的分解［31］，而外施GB促進了干旱脅迫過程中相關內源激素的合成［11，32］，從而緩解了葉綠素的降解。

研究表明，植物可以通過積累滲透調節(jié)物質如脯氨酸等，降低細胞滲透勢，提高細胞吸水能力，維持細胞膨壓，同時能夠穩(wěn)定酶和一些蛋白復合物等生物大分子的結構和功能，從而抵御干旱脅迫［2］。本試驗中，GB預處理顯著促進了干旱脅迫中匍匐翦股穎葉片脯氨酸的積累，并在復水后使其依然維持較高水平，其中100mmo／L處理濃度效果最佳。本研究中，干旱脅迫同時造成匍匐翦股穎葉片可溶性蛋白含量的下降，外施GB提高了可溶性蛋白含量并高于對照，這與Iqbal等［10］的研究結果一致。說明干旱脅迫抑制了部分蛋白質的合成，而GB可能誘導合成了更多對干旱更穩(wěn)定的耐旱蛋白，使蛋白質的合成依然大于分解。同時，可溶性蛋白也可以提高細胞滲透勢，從而提高匍匐翦股穎的抗旱性。

植物在干旱脅迫下生成大量活性氧，引起活性氧清除系統(tǒng)平衡的破壞和膜脂過氧化作用［1，33－34］。SOD、CAT和POD是抗氧化調節(jié)系統(tǒng)中的關鍵酶，清除植物體因環(huán)境脅迫生成的過多氧化產物和阻止自由基的形成。SOD是超氧陰離子的清除劑，通過催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應，生成H2O2和O2；CAT可以清除高濃度的H2O2，將H2O2轉化為H2O和O2；而POD主要作用于低濃度的H2O2。這3種酶在植物體內通過合理調節(jié)抗氧化系統(tǒng)，在植物應對干旱等脅迫過程中發(fā)揮著重要作用［33，35－36］。本研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化酶活性隨著干旱程度的加劇而升高，而復水后酶活性迅速降低，說明缺水是抗氧化酶活性的調控因子之一。干旱脅迫過程中，與對照相比GB處理提高了抗氧化酶活性，其中對SOD和CAT活性影響較為顯著，并以100mmol／L處理效果最好。以SOD為例，干旱中后期（D2，D3），對照葉片SOD活性幾乎保持不變，說明酶活性達到飽和，而GB處理后酶活性進一步提高，表明外源GB處理可以提高抗氧化酶活性，有利于清除匍匐翦股穎體內過多的活性氧，減緩了干旱脅迫對植物細胞的過氧化傷害，從而維持了膜系統(tǒng)的完整［35－36］。這可能與GB作為分子伴侶在滲透脅迫下穩(wěn)定抗氧化酶等生物大分子的結構和功能有關，也可能是由于GB參與了超氧陰離子非酶途徑的清除，直接緩解了氧化損傷。復水后，葉片抗氧化酶活性依然保持較高水平，甚至高于干旱初期，說明干旱脅迫使匍匐翦股穎的抗旱性得到增強，同時GB處理后的葉片抗氧化酶活性依然保持較高水平，說明GB處理使匍匐翦股穎積累了更多的抗旱能力。

植物遭受環(huán)境脅迫時，自由基的大量積累會對細胞膜造成一定傷害，而電導率（EL）和膜脂過氧化產物（MDA）是檢測細胞膜傷害程度的重要指標［37］。本試驗中，外源GB的施加減緩了匍匐翦股穎葉片EL和MDA含量的升高，并在復水后使其依然維持較低水平，說明GB能夠緩解干旱脅迫對匍匐翦股穎造成的膜脂過氧化反應，維持細胞膜的正常結構與功能，并且對于修復干旱對植物造成的損傷有一定作用。有文獻報道，這種緩解作用歸因于GB參與了干旱脅迫下植物體的抗氧化反應，從而降低了脅迫對植物造成的氧化損傷［38］。復水后，對照葉片EL依然小幅度上升而GB處理則基本不變，但是對照和GB處理組的MDA含量均出現(xiàn)大幅度下降，二者變化趨勢有所差異說明MDA含量的降低不僅能夠通過細胞膜的修復，復水處理可能誘發(fā)了其他清除MDA的途徑。

此外本試驗發(fā)現(xiàn)，GB對匍匐翦股穎抗旱性的調控呈現(xiàn)一定劑量效應，即在小于100mmol／L濃度GB處理時，抗旱性與濃度的增加表現(xiàn)為正相關，而施加更高濃度的外源GB時，并沒有繼續(xù)提高匍匐翦股穎的抗旱性。說明過高濃度的GB可能對匍匐翦股穎造成一定的滲透脅迫，不利于匍匐翦股穎的正常生長。

4 結論

綜上所述，外施適宜濃度的GB可以緩解干旱脅迫對匍匐翦股穎造成的不利影響，并且使匍匐翦股穎在復水后部分或全部恢復干旱所造成的損傷，從而積累了更多對干旱逆境的防御能力，使匍匐翦股穎更好地適應多變低水環(huán)境，這對于提高匍匐翦股穎的耐旱性具有實踐性意義，且本試驗發(fā)現(xiàn)100mmol／L濃度的GB效果最好。從最終研究結果來看，GB之所以能夠較好的調控匍匐翦股穎抗旱性，一方面在于維持了匍匐翦股穎葉片細胞較高的滲透調節(jié)作用，以保證水分的合理利用，另一方面在于它能夠提高匍匐翦股穎抗氧化代謝能力，及時清除干旱脅迫過程中產生的過量活性氧。雖然其作用機理已被初步揭示，但GB參與的抗旱代謝途徑以及與GB有關的抗旱調控物質的具體作用還有待進一步研究。

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