BNIP3表達(dá)載體轉(zhuǎn)染對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC-7901生物學(xué)行為的影響

李能蓮，張立，張秋菊，李長(zhǎng)天，舍雅莉，駱亞莉

（甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000）

BNIP3表達(dá)載體轉(zhuǎn)染對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC-7901生物學(xué)行為的影響

李能蓮，張立，張秋菊，李長(zhǎng)天，舍雅莉，駱亞莉

（甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000）

目的觀察BcL-2與腺病毒E1B 19KDa相互作用蛋白3（BNIP3）高表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖以及對(duì)化療藥物敏感性的影響。方法免疫細(xì)胞化學(xué)法篩選BNIP3表達(dá)陰性或表達(dá)相對(duì)較低的胃癌細(xì)胞株；BNIP3真核表達(dá)載體pcDNA3.1-BNIP3-FLAG通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞；Western blot進(jìn)行鑒定；MTT法和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖情況；MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)常規(guī)化療藥5-氟尿嘧啶（5-Fu）的敏感性。結(jié)果SGC-7901和BGC-823細(xì)胞均有BNIP3表達(dá)，表達(dá)水平SGC-7901低于BGC-823（P＜0.05）；與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1組比較，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-BNIP3-FLAG組BNIP3相對(duì)表達(dá)量顯著增高（P＜0.05），轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-BNIP3-FLAG組5-Fu的IC50值顯著降低（P＜0.05），細(xì)胞克隆形成率顯著降低（P＜0.05），細(xì)胞增殖速度減慢。結(jié)論BNIP3在胃癌細(xì)胞中高表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)化療藥物5-Fu的敏感性。

BNIP3；胃癌；SGC-7901；轉(zhuǎn)染

分子靶向治療已成為當(dāng)前腫瘤治療研究的熱點(diǎn)。Bcl-2與腺病毒E1B 19kDa相互作用蛋白3（bc1-2／adenovirus E1B 19kDa interacting protein3，BNIP3）是Bcl-2家族促凋亡蛋白。許多研究發(fā)現(xiàn)在胰腺癌[1]和一些造血系統(tǒng)[2]、結(jié)腸直腸[3]、胃[4]部惡性腫瘤中BNIP3表達(dá)下調(diào)，且與腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)。我們?cè)谇捌谘芯恐幸惨呀?jīng)證實(shí)，BNIP3在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，致使瘤細(xì)胞得以生存[5，6]，提示BNIP3低表達(dá)或失活在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。如果BNIP3恢復(fù)表達(dá)或使其過(guò)表達(dá)，則有可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，還可能逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)篩選BNIP3表達(dá)相對(duì)較低的胃癌細(xì)胞株，應(yīng)用BNIP3表達(dá)載體轉(zhuǎn)染以增強(qiáng)BNIP3的表達(dá)，觀察腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的變化（如增殖、凋亡等），探討以BNIP3為靶點(diǎn)治療胃癌的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

人胃癌細(xì)胞株SGC-7901，BGC-823（甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供），RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），小牛血清（杭州四季清公司），BCA蛋白濃度試劑盒（上海碧云天公司），BNIP3鼠抗人單克隆抗體（英國(guó)Abcam公司），羊抗鼠IgG、鼠單抗β-actin（美國(guó)Sigma公司），二甲基四氮唑藍(lán)（MTT，美國(guó)Sigma公司），5-氟尿嘧啶（5-Fu，天津金耀氨基酸公司），SP-免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒（北京中杉金橋公司），G418（德國(guó)Merk公司），陽(yáng)離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000（美國(guó)Invitrogen公司），BNIP3表達(dá)載體pcDNA3.1-BNIP3-FLAG（美國(guó)匹茲堡大學(xué)艾軍魁博士構(gòu)建并惠贈(zèng)，pcDNA3.1質(zhì)粒具有新霉素抗性基因）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)分別將人胃癌細(xì)胞株SGC-7901、BGC-823培養(yǎng)于RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液，常規(guī)37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901、BGC-823細(xì)胞分別接種12孔板進(jìn)行細(xì)胞爬片，按免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒說(shuō)明書(shū)常規(guī)檢測(cè)BNIP3在兩種細(xì)胞中的表達(dá)。染色結(jié)果用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)分析，選取BNIP3表達(dá)水平相對(duì)較低的細(xì)胞株進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 G418篩選濃度的確定將SGC-7901單細(xì)胞懸液接種于24孔板，G418按0、100～1 100 μg/ml的終濃度依次加入各孔中，各濃度設(shè)復(fù)孔，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，以第10天細(xì)胞全部死亡的最低濃度為G418的篩選濃度。

1.2.4 基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分3組：BNIP3表達(dá)載體pcDNA3.1-BNIP3-FLAG轉(zhuǎn)染組、空載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組和非轉(zhuǎn)染組。按LipofectamineTM2000試劑盒中的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞分別命名為SGC-7901-BNIP3+、SGC-7901-neo、SGC-7901。

1.2.5 Western blot檢測(cè)BNIP3的表達(dá)蛋白提取和蛋白濃度測(cè)定按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，Western blot檢測(cè)按常規(guī)操作程序進(jìn)行，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉，一抗為鼠抗人BNIP3單克隆抗體（1∶800），二抗為辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（1∶5 000），DAB顯色，β－actin為內(nèi)參照。晾干的NC膜用Mcrotec scanMaker E6系統(tǒng)掃描，Quantity One4．1圖像分析軟件測(cè)定各顯色條帶的積分吸光度D值，以目的蛋白/β－actin吸光度值表示。

1.2.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖將制成單細(xì)胞懸液的各組細(xì)胞，接種于96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h、96 h、120 h時(shí)，MTT法常規(guī)染色，酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm處的光密度D（490）值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，每組平均D（490）值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.7 平板克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖將生長(zhǎng)旺盛的各組細(xì)胞分別接種于直徑為60 mm的培養(yǎng)皿，每組設(shè)3個(gè)平行皿，每皿依次含50、100、200個(gè)細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)兩周，培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞克隆時(shí)終止培養(yǎng)。乙醇固定，姬姆薩染色。將干燥后的培養(yǎng)皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，肉眼直接計(jì)數(shù)克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率：克隆形成率（%）=克隆數(shù)÷接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.8 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞對(duì)5-Fu的敏感性SGC－7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3．1或重組質(zhì)粒pcDNA3．1－BNIP3－FLAG 48 h后，接種于96孔板繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每組加入不同濃度（0、10、20、40、80、160、320 μg/ml）的5－Fu，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)空白對(duì)照孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后MTT法染色，酶標(biāo)儀檢測(cè)D（490）值。計(jì)算藥物的細(xì)胞增殖抑制率，采用LOGIT法計(jì)算化療藥物IC50值。抑制率=[1－實(shí)驗(yàn)孔平均D（490）值÷對(duì)照孔平均D（490）值]×100%。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（±s）表示，P＜0．05為差異有顯著性。

圖1 BNIP3在不同細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)

2.1 免疫細(xì)胞化學(xué)

胃癌細(xì)胞SGC－7901、BGC－823的細(xì)胞質(zhì)中均可見(jiàn)BNIP3表達(dá)，表達(dá)水平（A值）SGC－7901（0．164±0．233）明顯低于BGC－823（0．392±0．163），P＜0．05，見(jiàn)圖1。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果

各組細(xì)胞經(jīng)G418（篩選最低濃度為600 μg/ml）加壓篩選8周后，BINP3表達(dá)載體pcDNA3．1－BNIP3－FLAG轉(zhuǎn)染組和空載體pcDNA3．1轉(zhuǎn)染組可見(jiàn)細(xì)胞克隆生長(zhǎng)，而非轉(zhuǎn)染組細(xì)胞全部死亡，細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。

2.3 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中BNIP3表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，SGC－7901、SGC－7901－neo、SGC－7901－BNIP3+組的BNIP3相對(duì)表達(dá)量分別為：（0．216± 0．067）、（0．279±0．012）、（0．974±0．005）。后者較前兩組顯著升高（P＜0．05），前兩組之間差異無(wú)顯著性（P＞0．05）。

2.4 MTT檢測(cè)5-Fu敏感性

SGC－7901、SGC－7901－neo、SGC－7901－BNIP3+各組細(xì)胞5－Fu的IC50值分別為（60．13±3．44）、（53．40±3．71）、（26．08±1．68）μg/ml。與前兩組比較，SGC－7901－BNIP3+組細(xì)胞5－Fu的IC50值顯著降低（P＜0．05）。

2.5 MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

MTT法連續(xù)5 d檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況，結(jié)果表明，SGC－7901－BNIP3+組細(xì)胞增殖能力明顯低于SGC－7901－neo組和SGC－7901組（P＜0．05）。后兩組間細(xì)胞增殖能力差異無(wú)顯著性（P＞0．05），見(jiàn)圖2。

2.6 平板克隆形成

SGC－7901、SGC－7901－neo、SGC－7901－BNIP3+組的克隆形成率分別為（29．20±2．48）%、（17．90±1．83）%、（10．07±1．33）%，前兩組明顯高于第三組（P＜0．05），前兩組間差異無(wú)顯著性（P＞0．05)，見(jiàn)圖3。

圖2 各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

圖3 各組克隆形成觀察（接種細(xì)胞數(shù)：200個(gè)/皿）

2 結(jié)果

3 討論

BNIP3是在酵母蛋白雙雜交篩選中被發(fā)現(xiàn)的能與腺病毒E1B19kDa（一個(gè)Bcl-2的同系物）相互作用的促凋亡蛋白。在生理?xiàng)l件下，BNIP3低水平表達(dá)在骨骼肌和腦組織中[7]，但在低氧條件下，BNIP3可以通過(guò)HIF信號(hào)通路被誘導(dǎo)表達(dá)，導(dǎo)致線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，PTP）開(kāi)放，消除質(zhì)子電化學(xué)梯度，引起染色質(zhì)凝聚，DNA損傷[8]，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。我們?cè)谇捌谘芯恐幸呀?jīng)證實(shí)，BNIP3是HIF-1α的靶基因，而且在胃癌的發(fā)生過(guò)程中，BNIP3誘導(dǎo)表達(dá)屬早期事件，一旦腫瘤發(fā)生，BNIP3在癌組織中的表達(dá)就會(huì)受到抑制（如被EGF、IGF等抑制[9]）。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)轉(zhuǎn)基因法，使低表達(dá)BNIP3的胃癌SGC-7901細(xì)胞恢復(fù)BNIP3表達(dá)或過(guò)表達(dá)，則SGC-7901細(xì)胞增殖能力顯著降低，BNIP3高表達(dá)可以增加癌細(xì)胞對(duì)5-Fu的敏感性，說(shuō)明化療藥物的增敏與BNIP3促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞的凋亡、抑制細(xì)胞增殖有關(guān)。這些結(jié)果提示，BNIP3表達(dá)下調(diào)致使胃癌細(xì)胞逃避低氧誘導(dǎo)的凋亡反應(yīng)，可能是胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要事件之一，BNIP3有可能成為靶向性藥物攻擊的重要環(huán)節(jié)。因此，對(duì)BNIP3在腫瘤中作用機(jī)制的進(jìn)一步研究，將有助于建立個(gè)性化的腫瘤治療方法。

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R730.23

B

1671-1246（2015）05-0105-03

注：本文系2010年甘肅省教育廳第二批科研計(jì)劃項(xiàng)目（1006B-09）；2011年蘭州市科技局第二批計(jì)劃項(xiàng)目（BH2011-082）