靶向沉默Notch-1基因抑制滋養(yǎng)細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004）

靶向沉默Notch-1基因抑制滋養(yǎng)細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究

尉陽，王蕾蕾，尚濤

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004）

目的探討靶向沉默Notch-1基因?qū)ψ甜B(yǎng)細(xì)胞JEG-3上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程和侵襲能力的影響及相關(guān)機(jī)制。方法設(shè)計合成Notch-1-siRNA干擾片段，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染JEG-3細(xì)胞。采用Transwell小室侵襲實驗檢測滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力的變化。采用Western blot檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞Notch-1蛋白、E-cadherin、vimentin蛋白的表達(dá)和EMT轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子slug，snail，twist的表達(dá)水平變化。結(jié)果轉(zhuǎn)染Notch-1-siRNA后，滋養(yǎng)細(xì)胞JEG-3中Notch-1蛋白的相對表達(dá)量明顯下降；滋養(yǎng)細(xì)胞JEG-3的侵襲能力明顯降低；JEG-3細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)顯著升高，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物vimentin表達(dá)顯著下降；EMT轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子slug、snail和twist的表達(dá)顯著下降。結(jié)論靶向沉默Notch-1基因能夠影響滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤；Notch-1通過調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞EMT過程降低其侵襲能力。

子癇前期；侵襲；Notch-1；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

子癇前期（preeclampsia，PE）是一種常見的妊娠并發(fā)癥，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒死亡的重要原因之一，其病因和發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤不足致子宮螺旋動脈重構(gòu)障礙是PE的發(fā)病基礎(chǔ)［1］。研究還發(fā)現(xiàn)，滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤機(jī)制與腫瘤細(xì)胞浸潤機(jī)制十分相近，都與細(xì)胞的上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程相關(guān)。滋養(yǎng)細(xì)胞表面受體與周圍細(xì)胞外基質(zhì)先發(fā)生黏附作用，之后再利用蛋白酶水解細(xì)胞外基質(zhì)成分，使滋養(yǎng)細(xì)胞向內(nèi)遷移，如此重復(fù)進(jìn)行，最終滋養(yǎng)細(xì)胞穿過上皮基膜得以侵入子宮內(nèi)膜［2］。滋養(yǎng)細(xì)胞的EMT過程一旦受到阻礙，滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤不足將直接導(dǎo)致子宮胎盤間的血液循環(huán)障礙，造成PE發(fā)病。因此，對影響滋養(yǎng)細(xì)胞EMT過程的機(jī)制研究將為探索PE的發(fā)病提供新的思路。

Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是決定細(xì)胞命運(yùn)的重要通路之一，與多種細(xì)胞、組織、器官的發(fā)生發(fā)育密切相關(guān)，并通過調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、存活、凋亡來決定細(xì)胞的命運(yùn)，在組織和胚胎發(fā)育中起重要作用［3］。Hunkapiller等［4］的研究表明Notch信號通路與小鼠胎盤的滋養(yǎng)層浸潤有關(guān)。但是，當(dāng)前關(guān)于Notch信號通路在PE中的調(diào)控機(jī)制仍有很多疑問，如Notch信號通路與滋養(yǎng)細(xì)胞EMT過程的關(guān)系及調(diào)控方式等均有待深入挖掘。研究Notch通路在胎盤植入、發(fā)育和形成過程中的具體作用，探討其表達(dá)變化在PE發(fā)病中的影響，將為今后的科研及臨床治療摸索新的途徑。本研究通過靶向沉默滋養(yǎng)細(xì)胞JEG-3中的Notch-1基因，探討其在抑制滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力和其EMT過程中的重要作用及機(jī)制，為預(yù)防和治療PE尋找新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

人滋養(yǎng)細(xì)胞株JEG-3購自北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)；RPMI1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶購自美國GIBCO公司；LipofectamineTM2000 Transfection Reagent購自美國Invitrogen公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；Immobilon-P Transfer membranes（PVDF）購自北京索來寶科技有限公司；Notch-1抗體購自美國CST公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Matrigel膠購自美國BD公司。根據(jù)siRNA設(shè)計原則，設(shè)計并合成2條Notch-1-siRNA干擾片段和1條帶有FITC標(biāo)記的陰性對照序列，委托上海吉瑪有限公司合成，干擾片段序列為：Notch-1-siRNA-1：F：5′CUGCGAG AUCAACCUGGAUUU3′，R：5′UUUCCAGGUUGAUC UCGCAG3′；Notch-1-siRNA-2：F：5′UCCAACCCUU GUGUCAACGUU3′，R：5′UUCGUUGACACAAGGGU UGG3′。E-cadherin抗體、vimentin抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；slug抗體、snail抗體、twist抗體購自英國Abcam公司；β-actin抗體購自美國Sigma公司；HRP標(biāo)記羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。實驗設(shè)置：未轉(zhuǎn)染細(xì)胞對照（Control）組、Lip2000轉(zhuǎn)染（Lip2000）組、Notch-1-siRNA-1轉(zhuǎn)染組、Notch-1-siRNA-2轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染siRNA陰性對照（NC）組。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：JEG-3細(xì)胞培養(yǎng)于含有15%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長。每3 d傳代1次，實驗均選用對數(shù)生長期細(xì)胞。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將干擾片段轉(zhuǎn)染進(jìn)JEG-3細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前1 d將培養(yǎng)瓶中細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，接種至6孔培養(yǎng)板中，第2天待細(xì)胞長成單層即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。配制轉(zhuǎn)染試劑：溶液1：無血清DMEM 240 μL與10 μL脂質(zhì)體2000（總體積250 μL/孔）混合，溫育5 min；溶液2：無血清DMEM/F12與4 μg質(zhì)粒（總體積250 μL/孔）混合。將溶液1與溶液2混合，室溫下放置20 min。將6孔板中的細(xì)胞用無血清DMEM沖洗細(xì)胞2遍后，加入1.5 mL無血清培養(yǎng)基。將溶液1與溶液2的混合液逐滴加入孔中，搖動培養(yǎng)板，輕輕混勻。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h。吸棄轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基上清，更換為含20%血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24 h后獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的滋養(yǎng)細(xì)胞克隆，于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.2 Transwell小室侵襲實驗：Matrigel膠4℃過夜解凍，置冰上放超凈臺中用無血清培養(yǎng)基將膠作1∶3逐級稀釋，先將10 μL Matrigel與10 μL培養(yǎng)基充分混勻，之后用20 μL培養(yǎng)基稀釋前述混合物，取出Transwell小室放入24孔板中，用20 μL預(yù)先稀釋好的Matrigel膠包被到小室膜上，在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置2 h使膠凝固。再將轉(zhuǎn)染24 h后的各組細(xì)胞及對照細(xì)胞棄培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞即將從培養(yǎng)瓶壁脫落時，棄多余的胰蛋白酶。加入無血清培養(yǎng)基，將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上吹落并分散成單細(xì)胞懸液。進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，稀釋至2.5×105/mL細(xì)胞懸液備用。將已包被好的Transwell小室放入24孔板中，下室加入含20%FBS的培養(yǎng)液800 μL；分別取細(xì)胞懸液200 μL加入上室，細(xì)胞數(shù)均為5×104/孔。置37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，PBS輕輕沖洗，上下各沖洗3次；用棉簽擦去微孔膜上層細(xì)胞；多聚甲醛室溫下固定20 min，蘇木素染液染色5 min，蒸餾水沖洗。在倒置顯微鏡下（×200）對遷移至微孔膜下層的細(xì)胞計數(shù)。每個樣本選取5個視野計數(shù)細(xì)胞個數(shù)，取均數(shù)。

1.2.3 Western blot檢測EMT相關(guān)蛋白表達(dá)：胰蛋白酶消化收集各組細(xì)胞，PBS漂洗細(xì)胞。加入NP-40裂解液12 000 rpm，4℃離心10 min，分離得到上清為所需的蛋白質(zhì)抽提物。BCA法測定蛋白濃度，加樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%TTBS脫脂奶粉中室溫封閉1 h后分別加入稀釋抗Notch-1、E-cadherin、vimentin、slug、snail、twist抗體孵育過夜，洗膜，對應(yīng)二抗孵育，ECL顯色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)以x±s表示。采用ANOVA法進(jìn)行組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 獲得靶向沉默Notch-1基因的JEG-3細(xì)胞克隆

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后即置于熒光顯微鏡下觀察，未見發(fā)出熒光的細(xì)胞（圖1B），轉(zhuǎn)染24 h后發(fā)出熒光的細(xì)胞數(shù)目達(dá)50%以上，達(dá)到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（圖1D）。

圖1 轉(zhuǎn)染效率檢測 ×200Fig.1 Transfection efficiency×200

2.2 轉(zhuǎn)染Notch-1-siRNA后Notch-1蛋白的相對表達(dá)量明顯減少

Western blot檢測Notch-1蛋白的表達(dá)結(jié)果如圖2所示：與對照組相比，陰性對照組Notch-1蛋白的相對表達(dá)量無顯著變化，Notch-1-siRNA-1和Notch-1-siRNA-2轉(zhuǎn)染組Notch-1蛋白的相對表達(dá)量分別減少了61%和63%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。表明干擾片段Notch-1-siRNA-1和Notch-1-siRNA-2能夠有效干擾Notch-1蛋白的表達(dá)。

圖2 轉(zhuǎn)染后各組Notch-1蛋白的表達(dá)（n=5）Fig.2 Notch-1 protein expression after transfection with siRNA plasmids in each group（n=5）

2.3 轉(zhuǎn)染Notch-1-siRNA后滋養(yǎng)細(xì)胞JEG-3的侵襲能力明顯下降

Transwell檢測細(xì)胞侵襲結(jié)果見圖3。200倍顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞侵襲個數(shù)結(jié)果見圖4。24 h Notch-1-siRNA-1組和Notch-1-siRNA-2組侵襲細(xì)胞個數(shù)均顯著低于對照組（P＜0.01）。提示沉默Notch-1能夠降低滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力。

2.4 靶向沉默Notch-1基因抑制滋養(yǎng)細(xì)胞EMT

為探討Notch-1蛋白受抑制后對滋養(yǎng)細(xì)胞EMT變化的影響，采用Western blot方法檢測轉(zhuǎn)染Notch-1-siRNA后，各組JEG-3細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白上皮E -cadherin和vimentin表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示：與對照組相比，轉(zhuǎn)染Notch-1-siRNA片段1和2后，JEG-3細(xì)胞中的上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)明顯升高而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物vimentin表達(dá)明顯下降（P＜0.01，圖5），說明靶向沉默Notch-1基因通過抑制滋養(yǎng)細(xì)胞JEG-3的EMT過程，阻礙滋養(yǎng)細(xì)胞由上皮表型向間質(zhì)表型的轉(zhuǎn)化，從而起到降低滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力的作用。

2.5 靶向沉默Notch-1基因通過下調(diào)slug、snail、twist途徑抑制滋養(yǎng)細(xì)胞EMT

Western blot檢測結(jié)果顯示：與對照組相比，轉(zhuǎn)染Notch-1-siRNA片段1和2后，EMT轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子slug、snail和twist在滋養(yǎng)細(xì)胞JEG-3中的表達(dá)顯著下降（P＜0.01，圖6）。提示Notch-1蛋白可通過slug等各信號網(wǎng)絡(luò)間的串話作用調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞的EMT，靶向沉默Notch-1基因是通過下調(diào)slug、snail和twist等轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的表達(dá)抑制滋養(yǎng)細(xì)胞EMT來降低其侵襲能力。

圖3 Transwell檢測細(xì)胞侵襲 ×200Fig.3 Invasive ability of trophoblasts detected by Transwell×200

圖4 各組侵襲細(xì)胞個數(shù)的比較（n=5）Fig.4 Comparison of invasive cells counts in each group（n=5）

圖5 Western blot檢測轉(zhuǎn)染Notch-1-siRNA后細(xì)胞中E-cadherin和vimentin的表達(dá)Fig.5 Western blot detection for expression of E-cadherin and vimentin in trophoblasts after transfection with Notch-1-siRNA plasmids

3 討論

PE是一種胎盤相關(guān)性疾病，大部分學(xué)者認(rèn)為滋養(yǎng)層淺植入，即滋養(yǎng)細(xì)胞功能障礙，是導(dǎo)致PE發(fā)病的原因［5］。PE患者胎盤的主要病理表現(xiàn)為滋養(yǎng)細(xì)胞侵入內(nèi)膜過淺以及子宮螺旋小動脈生理性血管重塑障礙，絨毛面積減小、密度降低等。當(dāng)妊娠期胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤能力降低時會引起胎盤灌注不足，進(jìn)一步導(dǎo)致胎盤缺血缺氧、代謝障礙，進(jìn)而引起血管內(nèi)皮損傷、血管活性物質(zhì)失衡，引發(fā)嚴(yán)重的病理改變，最終發(fā)展為PE［6］。在人類胚胎植入過程中，滋養(yǎng)細(xì)胞的侵入與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程類似，與其不同的是，滋養(yǎng)細(xì)胞的侵入受到嚴(yán)格的時序調(diào)控。在這個調(diào)控過程中，多種細(xì)胞因子互相作用，共同調(diào)節(jié)著滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力。

圖6 Western blot檢測轉(zhuǎn)染Notch-1-siRNA后細(xì)胞中slug、snail、twist蛋白表達(dá)Fig.6 Western blot detection for protein expression of slug，snail，twist in trophoblasts after transfection with Notch-1-siRNA plasmids

Notch蛋白在多個物種中廣泛存在，進(jìn)化上極為保守，作為跨膜受體蛋白，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、黏附、EMT及胚胎發(fā)育和血管形成等活動中均起重要的調(diào)節(jié)作用［7］。研究表明，Notch蛋白家族可能參與了滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤以及血管生成的調(diào)控，是母胎界面血管床發(fā)育的必須因子。Cobellis等［8］發(fā)現(xiàn)PE患者胎盤標(biāo)本中部分Notch的受體表達(dá)下調(diào)。此后，Hunkapiller等［4］進(jìn)一步證實了PE胎盤中存在Notch配體jagged1的表達(dá)下調(diào)，據(jù)此推測Notch蛋白及其受體在母胎界面的異常表達(dá)能夠直接影響滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移和浸潤，進(jìn)一步影響母胎界面血管床的發(fā)育。本研究采用RNAi技術(shù)抑制了滋養(yǎng)細(xì)胞系JEG-3中Notch-1的表達(dá)，并利用Transwell小室對其侵襲能力進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示靶向沉默Notch-1基因后細(xì)胞侵襲能力顯著降低。表明Notch-1在滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤中發(fā)揮著重要作用，Notch-1表達(dá)的降低或缺失能夠影響滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤，參與PE的發(fā)病過程。

EMT是一種以上皮細(xì)胞標(biāo)志物如E-cadherin、細(xì)胞角蛋白等下調(diào)和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，如vimentin等，上調(diào)肌動蛋白細(xì)胞骨架重組，細(xì)胞間的黏附和極性丟失，干細(xì)胞樣特性出現(xiàn)等為特征的細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化過程［9］。在胚胎植入過程中，胚胎的侵入與子宮內(nèi)膜的接受必須達(dá)到“同步”狀態(tài)才能保證胚胎植入成功，在細(xì)胞接受性的獲得過程中，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的極性結(jié)構(gòu)將逐漸消失，特征性蛋白E-cadherin、vimentin表達(dá)發(fā)生改變，并且發(fā)生行為變化，從而便于滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入［10，11］。作為snail鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，slug是涉及胚胎發(fā)育的轉(zhuǎn)錄抑制子之一，是重要的EMT轉(zhuǎn)錄因子。slug能直接抑制與細(xì)胞間黏附相關(guān)基因（如E-cadherin等）的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中E-cadherin和蛋白酶的表達(dá)以及EMT，大量實驗表明，過量表達(dá)的slug能夠抑制E-cadherin的表達(dá)從而促進(jìn)EMT進(jìn)程并增加細(xì)胞侵襲能力［12］，這種作用同時也受到其他的EMT調(diào)控子（snail，twist）的補(bǔ)充［13，14］。對胚胎發(fā)育的研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子snail在調(diào)控胚胎EMT過程中也起重要作用。然而slug、snail和twist的功能是相互獨(dú)立還是協(xié)同作用目前還不完全清楚。本研究在對Notch-1進(jìn)行RNA干擾后，對EMT過程相關(guān)因子進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果表明Notch-1蛋白表達(dá)下調(diào)后，E-cadherin表達(dá)水平升高，vimentin蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.01），slug、snail、twist等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平降低（P＜0.01），提示Notch-1通路受到限制后slug、snail、twist等轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平受到影響，對E -cadherin的調(diào)控作用減弱，使細(xì)胞的黏附作用增強(qiáng)，細(xì)胞由上皮型向間質(zhì)型轉(zhuǎn)化能力降低，EMT過程受到抑制，進(jìn)一步影響JEG-3細(xì)胞的浸潤能力，參與PE的發(fā)病過程。本研究結(jié)果還顯示靶向沉默Notch -1的表達(dá)對slug、snail和twist的影響一致，表明各轉(zhuǎn)錄因子間可能是通過協(xié)同作用調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞的EMT過程，這與某些研究發(fā)現(xiàn)twist通過slug作用于EMT過程的結(jié)果相類似［15］。

PE的發(fā)病機(jī)制與Notch信號通路和滋養(yǎng)細(xì)胞的EMT過程均涉及到眾多復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制。本研究探討了Notch-1在調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞EMT過程中的作用機(jī)制，為闡明滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤不足導(dǎo)致PE發(fā)病的相關(guān)機(jī)制提供了實驗數(shù)據(jù)支撐，為預(yù)防和治療PE提供了新的針對性靶點(diǎn)，但Notch在調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞EMT過程中對各轉(zhuǎn)錄因子的具體調(diào)控方式仍有待進(jìn)一步的深入研究。

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（編輯王又冬）

Study on Inhibitive Mechanism ofEpithelial-mesenchymalTransition ofTrophoblastCellsby Targeted Silencing of Notch-1Gene

YUYang，WANGLei-lei，SHANGTao
（DepartmentofObstetricsand Gynecology，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110004，China）

Objective To discuss the effect and related mechanism on epithelial-mesenchymal transition（EMT）process and invasive ability of the trophoblasts JEG-3 by targeted silencing of Notch-1gene.MethodsNotch-1-siRNA interference fragmentwasdesigned and synthesized to stably transfect JEG-3 cells.Changes in the invasive ability of trophoblasts were detected by Transwell chamber invasion assay.The expressions of Notch-1，E-cadherin，vimentin and EMT transcriptive regulators slug，snail，twist were analyzed in transfected trophoblasts by Western blot.ResultsThe relative expression of Notch-1 protein in JEG-3 and the invasive ability of JEG-3 were significantly decreased after transfection with Notch-1-siRNA，the expression of the epithelial indictor E-cadherin was significantly increased while the mesenchymal indicator vimentin was decreased with the reduction ofEMT transcriptive regulators slug，snailand twist.ConclusionThe invasion oftrophoblastswasaffected by targeted silencing of Notch-1gene and Notch-1 can reduce the invasion oftrophoblasts through influencing EMT process.

preeclampsia；invasion；Notch-1；epithelial-mesenchymal transition

R714.24

A

0258-4646（2015）03-0238-06

尉陽（1977-），女，講師，博士. E-mail：weiy@sj-hospital.org

2014-12-05

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