一步法SYBR Green實(shí)時定量RT-PCR檢測坦布蘇病毒方法的建立

劉青濤， 李 銀， 趙冬敏， 劉宇卓， 黃欣梅， 楊 婧， 韓凱凱， 安鳳嬌

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部動物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室/國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇南京210014)

坦布蘇病毒(Tembusu Virus，TMUV)為單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科(Flaviviridae)，黃病毒屬(Flavivirus)，恩塔亞病毒群(Ntaya virus group)，該病毒于1955年首次分離于馬來西亞吉隆坡地區(qū)的庫蚊，隨后又在馬來西亞其他地區(qū)和泰國的庫蚊中分離到［1-3］。2000年，在馬來西亞霹靂州實(shí)兆遠(yuǎn)地區(qū)的患病肉雞中分離到TMUV，這是首次發(fā)現(xiàn)TMUV對家禽的致病性［4］。2010年春季，在中國東部省份主要養(yǎng)鴨地區(qū)的鴨群中暴發(fā)了由TMUV引起的疫情，主要表現(xiàn)為種鴨、蛋鴨釆食量和產(chǎn)蛋率迅速下降，肉鴨拉稀，出現(xiàn)神經(jīng)癥狀和死亡，此次疫情一直持續(xù)到2010年冬季［5-7］。2011年10月，在江蘇、山東、河南等地再次出現(xiàn)鴨坦布蘇病毒病的流行，一直持續(xù)到2012年3月。2012年9月，江蘇、山東等地再次發(fā)生鴨坦布蘇病毒?。?］。目前坦布蘇病毒病作為鴨的一種常見病，給中國養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)不完全統(tǒng)計，鴨坦布蘇病毒病僅2010年造成的經(jīng)濟(jì)損失就達(dá)數(shù)十億元。此外，TMUV還可以引起雞和鵝的感染和發(fā)?。?-10］，并且在人的血清中也檢測到TMUV的核酸和抗體［11］，不排除TMUV有人畜共患的風(fēng)險。

實(shí)時定量PCR是近年來發(fā)展起來的一種新型診斷技術(shù)，在各種疾病特別是傳染性疾病的快速診斷中發(fā)揮了重要作用。常規(guī)PCR通過PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果，而實(shí)時定量PCR是通過添加的熒光染料或熒光標(biāo)記探針在PCR過程中實(shí)時收集檢測信號，根據(jù)機(jī)器收集的熒光信號強(qiáng)度進(jìn)行結(jié)果的判定，減少了試驗(yàn)污染和環(huán)境污染。因此，與常規(guī)PCR相比，實(shí)時定量PCR的敏感性更高，檢測速度更快，并且更環(huán)保。國內(nèi)學(xué)者根據(jù)TMUV基因的不同區(qū)域建立了多種用于TMUV檢測的實(shí)時定量RT-PCR，于春梅等建立了基于TMUV NS5、E基因的SYBR GreenⅠ實(shí)時定量RT-PCR方法［12］，萬春和等根據(jù)TMUV的NS5基因設(shè)計引物建立了SYBR GreenⅠ實(shí)時定量 RT-PCR 方法［13］，彭珊和靳宇田等分別根據(jù)TMUV的E基因和PrM基因設(shè)計引物和探針建立了TaqMan實(shí)時定量RT-PCR方法［14-15］，以上方法均具有很好的特異性和敏感性，為鴨坦布蘇病毒病的臨床病原學(xué)診斷提供了檢測手段。但是，以上實(shí)時定量RT-PCR均采用兩步法，即在提取樣品的RNA后首先進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后再以轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行實(shí)時定量PCR方法測定，操作比較繁瑣，增加了試驗(yàn)過程中的操作誤差和樣品被污染的幾率。而本研究針對TMUV基因的保守區(qū)域設(shè)計了1對特異性引物，利用體外轉(zhuǎn)錄的TMUV病毒的NS2A基因作為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立了TMUV的一步法SYBR Green實(shí)時定量RT-PCR檢測方法。與兩步法相比，本方法操作簡單，檢測快速，減少了試驗(yàn)過程中的操作誤差和樣品被污染的幾率，為TMUV的快速診斷和流行病學(xué)研究提供有效的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

坦布蘇病毒(TMUV)、新城疫病毒(NDV)、H9N2禽流感病毒(H9N2 AIV)、鴨肝炎病毒(DHV)、鴨瘟病毒(DPV)、小鵝瘟病毒(GPV)、減蛋綜合征病毒(EDSV)、豬瘟病毒(CSFV)均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所分離并保存。1日齡櫻桃谷鴨購自南京市六合區(qū)，養(yǎng)至21日齡用于攻毒。

1.2 儀器和試劑

RNA/DNA和質(zhì)粒提取試劑盒購自康寧公司，T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購自百奧邁科生物技術(shù)有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、One Step RT-PCR Kit購自寶生物工程(大連)有限公司，ABI 7500 Real-Time PCR System購自美國Applied Biosystems公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室分離的病毒株以及GenBank登錄的TMUV全基因核苷酸序列，采用DNAStar軟件進(jìn)行同源性分析，選出高度保守并且特異的核苷酸區(qū)域，用Primer Ex-press 2.0軟件設(shè)計1對檢測引物，其序列為 D1:5'-GCAGCCCAGGAGATTTTGAG-3'和 D2:5'-CTAACGCAACGCCAAGCA-3'，擴(kuò)增片段大小為280 bp。另外，設(shè)計1對克隆引物將NS2A基因連接到pcDNA3.1(+)載體中，其序列為C1:5'-GGTCGGATCCTTTCAAGGGG-3'和C2:5'-CTGGTCTAGATCTCCGTGTCACTGG-3'。

1.4 病毒核酸的提取

按照試劑盒說明進(jìn)行病毒核酸的提取，以提取的核酸為模板直接進(jìn)行一步法SYBR Green實(shí)時定量RT-PCR檢測。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

將提取的TMUV核酸按照試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板用引物C1和C2 PCR擴(kuò)增TMUV的 NS2A基因，然后將擴(kuò)增基因片斷用BamH I和 Xba I進(jìn)行雙酶切，連接到 pcDNA3.1(+)載體中，經(jīng)測序正確后用于體外轉(zhuǎn)錄，并命名為pcDNA-NS2A。

將質(zhì)粒pcDNA-NS2A經(jīng)Xba I單酶切進(jìn)行線性化，然后按照試劑盒的說明進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，將體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用RNA提取試劑盒純化后，進(jìn)行濃度測定、拷貝數(shù)計算、稀釋、分裝，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 敏感性試驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將體外轉(zhuǎn)錄制備的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍系列稀釋(1 μl 1×100～1×107拷貝)作為模板進(jìn)行實(shí)時定量RT-PCR擴(kuò)增，以檢測出的最低拷貝數(shù)作為該方法的靈敏度，并與常規(guī)RT-PCR檢測方法進(jìn)行比較，同時根據(jù)測定結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)時定量RT-PCR的擴(kuò)增體系為:2 ×Buffer 10 μl，酶 0.8 μl，引物 D1(10 μmol/L)0.8 μl，引物 D2(10 μmol/L)0.8 μl，ROX Reference DyeII 0.4 μl，RNA 1 μl，H2O 6.2 μl。擴(kuò)增程序?yàn)?42℃ 5 min，95 ℃ 10 s;95 ℃ 15 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)，以3～15個循環(huán)數(shù)的熒光值作為基底值。

1.7 特異性試驗(yàn)

用建立的一步法SYBR Green實(shí)時定量RT-PCR方法分別對 NDV、H9N2 AIV、DHV、DPV、GPV、EDSV、CSFV進(jìn)行檢測，以TMUV為陽性對照，以滅菌超純水為陰性對照，評價所建立方法的特異性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

用建立的一步法SYBR Green實(shí)時定量RT-PCR方法對不同拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行3次定量測定，對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，計算批內(nèi)及批間的變異系數(shù)，驗(yàn)證所建立方法的重復(fù)性。

1.9 對TMUV攻毒樣品的檢測

取TMUV 0.2 ml［病毒含量為0.1 ml 1×105.7(雞胚半致死量)］肌肉注射3只21日齡櫻桃谷鴨，每只106［雞胚半致死量(ELD50)］，攻毒后1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、15 d、21 d 每天采集攻毒鴨的泄殖腔拭子，反復(fù)凍融3次后提取RNA，分別用一步法SYBR Green實(shí)時定量RT-PCR方法和常規(guī)PCR方法進(jìn)行檢測，同時設(shè)不攻毒的鴨為對照，比較2種方法的檢出率。

2 結(jié)果

2.1 敏感性試驗(yàn)及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

標(biāo)準(zhǔn)品(1 μl 1×100～1×107拷貝)的檢測結(jié)果顯示，建立的一步法SYBR Green實(shí)時定量RTPCR的檢測底限為1 μl 10拷貝(圖1)，而常規(guī)RT-PCR 的檢測底限為 1 μl 1×103拷貝(圖 2)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)與Ct值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)繪制，標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)為0.997，擴(kuò)增效率(Eff)為99.441%，說明所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系和擴(kuò)增效率。此外，由熔解曲線(圖4)可見，各擴(kuò)增樣品均為單一峰，無非特異性產(chǎn)物。以上結(jié)果說明，所建立的方法可以對大于等于1 μl 10拷貝的樣品進(jìn)行精確定量。

圖1 擴(kuò)增曲線Fig.1 Amplification plot

圖2 常規(guī)PCR敏感性試驗(yàn)Fig.2 Sensitivity of the conventional RT-PCR

DL2000:Marker;100、101、102、103、104、105、106、107為模板稀釋濃度。

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

一步法SYBR Green實(shí)時定量RT-PCR方法對NDV、H9N2 AIV、DHV、DPV、GPV、EDSV、CSFV 和滅菌超純水的檢測結(jié)果均為陰性，而對TMUV的檢測結(jié)果為陽性(圖5)，這說明所建立的方法具有良好的特異性。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve

圖4 溶解曲線Fig.4 Melt curve

圖5 特異性試驗(yàn)Fig.5 Specificity test

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，各樣品的批內(nèi)變異系數(shù)為0.11%～0.30%，批間變異系數(shù)為 0.88%～1.31%，說明所建立的方法重復(fù)性良好。

表1 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Reproducibility test

2.4 對TMUV攻毒樣品的檢測

由TMUV攻毒鴨泄殖腔棉拭子的檢測結(jié)果(表2)顯示，常規(guī)RT-PCR在攻毒后1 d，只從1只鴨的拭子中檢測到TMUV，21 d時已檢測不出TMUV;而一步法SYBR Green實(shí)時定量RT-PCR在攻毒后1 d到21 d在所有攻毒鴨的泄殖腔拭子中均檢測到了TMUV，其陽性檢出率為100%，而常規(guī)RT-PCR的陽性檢出率為71%。以上結(jié)果進(jìn)一步說明本研究建立的TMUV檢測方法的敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常規(guī)RTPCR檢測方法。此外，2種方法對對照鴨的檢測結(jié)果均為陰性。

3 討論

由于集約化養(yǎng)殖模式的發(fā)展，鴨的養(yǎng)殖密度越來越大，發(fā)病情況也越來越復(fù)雜，往往是幾種病原(包括新出現(xiàn)的病原)共同感染或者繼發(fā)感染發(fā)病，給疾病的診斷和處置造成了困難。2010年以來，鴨坦布蘇病毒病在中國已經(jīng)發(fā)生了3次較大規(guī)模的流行，目前該病在中國已成為鴨的一種常見?。?-8］。鴨坦布蘇病毒病作為一種新發(fā)疫病，因臨床癥狀不特異而難以診斷，因此迫切需要建立一種快速、準(zhǔn)確的病原檢測方法來對該病進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷。

本研究以TMUV基因的保守區(qū)為靶點(diǎn)設(shè)計1對特異引物，建立了一步法SYBR Green實(shí)時定量RTPCR檢測方法，并且對該方法的擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線、溶解曲線、敏感性、特異性和重復(fù)性進(jìn)行了分析和驗(yàn)證。結(jié)果表明，所建立的實(shí)時定量RT-PCR方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好;對TMUV的最低檢測量達(dá)到1 μl 10拷貝，靈敏度是常規(guī)RT-PCR檢測方法的100倍;溶解曲線呈單一峰，并且只能檢測出TMUV，與其他病原無交叉反應(yīng)，具有良好的特異性;批內(nèi)和批間變異系數(shù)較小，具有良好的重復(fù)性。利用建立的熒光定量RT-PCR方法和常規(guī)RT-PCR方法對不攻毒對照鴨和TMUV感染鴨的泄殖腔棉拭子進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明2種方法對于對照鴨的檢測結(jié)果均為陰性;而對于攻毒鴨一步法SYBR Green實(shí)時定量RT-PCR法檢測出TMUV的陽性率為100%，比常規(guī)RT-PCR方法高出29個百分點(diǎn)。因此，與常規(guī)RT-PCR方法相比，我們建立的一步法SYBR Green實(shí)時定量RT-PCR方法檢測速度更快、更敏感，更適合于臨床樣品的檢測。

表2 TMUV攻毒鴨泄殖腔棉拭子測定結(jié)果Table 2 Detection of TMUV in cloacal swabs from TMUV infected ducks

本研究建立的一步法SYBR Green實(shí)時定量RT-PCR方法為坦布蘇病毒病的實(shí)驗(yàn)室診斷提供了一種快速有效的方法，也為開展坦布蘇病毒病的流行病學(xué)調(diào)查提供了技術(shù)手段。

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