甘藍(lán)型油菜CRABS CLAW基因克隆及其RNA干擾載體的構(gòu)建

周曉嬰， 付三雄， 陳 松， 張 超， 戚存扣

(1.國(guó)家油菜改良中心南京分中心，江蘇 南京 210014;2.農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)江下游棉花與油菜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014;3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，江蘇 南京 210014)

植物雌性不育通常由雌性器官發(fā)育異常引起，雌性不育表型具有多樣性，不育機(jī)理復(fù)雜。了解其細(xì)胞分子機(jī)理對(duì)揭示植物花器官發(fā)育的分子機(jī)理以及在生產(chǎn)中克服不育性和利用雌性不育作為雜交育種手段等都具有重要的理論與實(shí)踐意義［1］。

甘藍(lán)型油菜雌性不育突變體FS-M1于1996年在甘藍(lán)型油菜(Brassica napus L.)品種寧油10號(hào)的135個(gè)株系群體中偶然被發(fā)現(xiàn)。形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)突變株FS-M1雌蕊明顯短于雄蕊，無(wú)蜜腺，柱頭乳突細(xì)胞較大但數(shù)量較少，粘附花粉能力弱，柱頭授粉功能缺陷。切除柱頭及部分花柱后再授粉，在FS-M1花柱中觀察到伸長(zhǎng)的花粉管，授精結(jié)角也接近正常。FS-M1雌性不育現(xiàn)象可能與柱頭乳突細(xì)胞發(fā)育畸變和功能缺失有關(guān)，與自交不親和無(wú)關(guān)［2-3］。遺傳研究結(jié)果顯示FS-M1的突變性狀由2對(duì)隱性基因控制，遺傳性狀穩(wěn)定，植株花粉育性正常［4］。

付三雄曾利用Agilent公司生產(chǎn)的油菜全基因組4×44K芯片比較了油菜FS-M1及其野生型花器官的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)突變體花器官組織1個(gè)CRABS CLAW(CRC)轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)量顯著下調(diào)。本研究為了進(jìn)一步驗(yàn)證CRC轉(zhuǎn)錄因子在油菜花器官發(fā)育中的作用，以及導(dǎo)致油菜FS-M1雌性不育性狀的決定因素是否與CRC基因表達(dá)量顯著下調(diào)有關(guān)，根據(jù)同源序列克隆了甘藍(lán)型油菜CRC基因，并構(gòu)建CRC基因干擾表達(dá)載體，擬通過(guò)轉(zhuǎn)基因來(lái)驗(yàn)證CRC基因的功能，明確CRC基因下調(diào)表達(dá)與FS-M1雌性不育的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

克隆載體pEASY-T1及感受態(tài)大腸桿菌DH5ɑ購(gòu)自南京百斯凱公司，RNA提取試劑盒為Promega公司產(chǎn)品，瓊脂糖凝膠回收試劑盒及細(xì)菌質(zhì)粒小量提取試劑盒均購(gòu)自北京天根生物有限公司，Ex Taq、DNA Marker、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、各種限制性內(nèi)切酶(如 EcoR I、Xho I、Hin III、BamH I、Not I等)、T4連接酶、堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase)均購(gòu)自TaKaRa公司，X-gal、IPTG、酵母提取物、蛋白胨、抗生素等購(gòu)自南京基天生物公司。測(cè)序由上海英駿公司完成。

中間載體pHurricane、表達(dá)載體 pCAMBIA1390系本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 CRC基因克隆

本試驗(yàn)依據(jù)已經(jīng)公開(kāi)的甘藍(lán)型油菜CRC基因cDNA序列(登錄號(hào)為XM00910 7216)設(shè)計(jì)RT-PCR引物。引物同時(shí)引進(jìn) NotⅠ和 XhoⅠ酶切位點(diǎn)，CRCXNFF:5'-CTCGAGCGGCCGCATGAACCTTGAA GAGAAACC-3'，CRCXNR R:5'-CTCGAGCGGCCGCATTTCCTTGGGCTATCACCTT-3'，以甘藍(lán)型油菜品種寧油10號(hào)花蕾RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，采用Ex Taq酶PCR擴(kuò)增靶基因序列片段，將目標(biāo)條帶克隆到pEASY-T1載體上，挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序，并與目標(biāo)序列進(jìn)行比對(duì)分析，獲得含CRC基因片段的克隆載體pT-CRC。

1.3 CRC基因反向重復(fù)框構(gòu)建

根據(jù)中間載體pHurricane內(nèi)含子序列設(shè)計(jì)特異性引物:INTRONFW:5'-CGTATTCTCAACGCAATC-3'，和 INTRONRV:5'-CAAAGTGGGAAATCAGGT-3'，用于鑒別靶序列插入方向。用 Not I酶切pT1-CRC，回收580bp目的片段。同時(shí)利用Not I酶切pHurricane載體，并進(jìn)行末端去磷酸化處理后，再與目的片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌。采用INTRONRV和CRCXNF引物對(duì)鑒定正向插入的陽(yáng)性克隆，此時(shí)獲得的中間載體命名為pH-CRCF。再用Xho I酶切pT-CRC，回收580 bp目的片段，用Xho I酶切pH-CRCF載體，并去磷酸化處理、純化后與目的片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌。用INTRONFW和CRCXNF引物對(duì)進(jìn)行菌落PCR，選擇反向插入的陽(yáng)性克隆。此時(shí)獲得的中間載體命名為pH-CRCir，包含目的基因反向重復(fù)框。

1.4 CRC干擾表達(dá)載體的組裝及酶切鑒定

本試驗(yàn)選擇CaMV35S啟動(dòng)子作為CRC反向重復(fù)序列表達(dá)框的啟動(dòng)子。以pCAMBIA1390質(zhì)粒DNA為模板，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，在35SHF 5'端加Hind III的酶切位點(diǎn)，在35SBR 5'端增加BamH I的酶切位點(diǎn)。35SHF:5'-AAGCTTATGGTGGAGCACGACACTCT-3'，35SBR:5'-GGATCCAGAGATAGATTTGTA GAGAG-3'，擴(kuò)增35S序列，先將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pEASY-T載體上，再用Hind III和Bam H I雙酶切獲得780bp大小的35S啟動(dòng)子序列，再組裝到pCAMBIA1390載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)上，得中間載體pCAMBIA1390-35S。

用BamHⅠ和EcoRⅠ分別雙酶切pCAMBIA1390-35S和pH-CRCir，回收純化線性化的pCAMBIA1390-35S載體片段和大小約2.3 kb的CRC正反向重復(fù)框片段，將回收產(chǎn)物用T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。用CRCXNF和CRCXNR引物進(jìn)行菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆，并提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒DNA，分別用單酶切(HindⅢ)和雙酶切(BamHⅠ和EcoRⅠ)進(jìn)行鑒定并測(cè)序，獲得的載體定名為pA6-CRCi。

2 結(jié)果

2.1 油菜CRC基因片段克隆與序列分析

本研究對(duì)甘藍(lán)型油菜寧油10號(hào)花蕾RNA進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增到1個(gè)約580 bp大小的產(chǎn)物(圖1)。經(jīng)克隆測(cè)序，并用BioXM軟件對(duì)其核酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該cDNA全長(zhǎng)580 bp，具有1個(gè)編碼193個(gè)氨基酸的開(kāi)放式閱讀框。

圖1 CRC基因克隆菌落PCR鑒定結(jié)果Fig.1 The PCR amplification of CRC gene clones

用BLAST在線分析軟件進(jìn)一步將所克隆的cDNA序列與GenBank中登錄的油菜、擬南芥等多種植物的CRC基因cDNA序列進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)該核苷酸序列與油菜、擬南芥、非洲獨(dú)行菜、蕓薹、甘藍(lán)等植物中的CRC基因序列高度同源，相似性大于90%，其中與甘藍(lán)型油菜CRC基因的cDNA序列(XM 009107216)同源性達(dá)99%，表明所克隆序列即為油菜CRC基因序列，此克隆定名為pT-CRC。

2.2 油菜CRC基因反向重復(fù)表達(dá)框構(gòu)建及酶切鑒定

將2.1克隆到的CRC基因片段分2步，依次克隆到中間載體pHurricane內(nèi)含子兩側(cè)的Not I和Xho I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。分別利用內(nèi)含子上的引物INTRONRV和INTRONFW與干擾片段的上游引物CRCNX F組合進(jìn)行菌液PCR鑒定，可以篩選到干擾片段正向插入Not I位點(diǎn)的陽(yáng)性克隆和反向插入Xho I位點(diǎn)的陽(yáng)性克隆(圖2)。

圖2 PCR鑒定CRC基因片段插入正反方向克隆Fig.2 PCR identification of CRC positive clones

培養(yǎng)經(jīng)PCR鑒定后的陽(yáng)性克隆菌株，提取質(zhì)粒，分別用Not I和Xho I限制性內(nèi)切酶酶切，均可以切出大小約580 bp的條帶(圖3)。進(jìn)一步用BamH I和EcoR I限制性酶進(jìn)行雙酶切，可以獲得大小2.29 kb左右的片段(圖3)，該片段包含有正向插入、反向插入的干擾片段和內(nèi)含子片段，表明CRC基因片段已成功連接到中間載體的相應(yīng)酶切位點(diǎn)上。

圖3 酶切鑒定pH-CRCirFig.3 Enzymatic identification of pH-CRCir

2.3 CRC基因ihpRNAi植物表達(dá)載體構(gòu)建

為構(gòu)建組成型表達(dá)的CRC基因的干擾載體，本研究選擇CaMV35S啟動(dòng)子作為CRC反向重復(fù)表達(dá)框的啟動(dòng)子。首先通過(guò)PCR從pCAMBIA1390上擴(kuò)增1個(gè)780 bp的增強(qiáng)型CaMV35S啟動(dòng)子，再經(jīng)過(guò)酶切與連接等步驟，將 CaMV35S啟動(dòng)子連接到pCAMBIA1390雙元表達(dá)載體的Hind III和BamH I位點(diǎn)上，再用BamH I和EcoR I雙酶切，獲得2.29 kb的CRC基因反向重復(fù)框片段，與同樣雙酶切的pCAMBIA1390-35S載體片段連接后最終形成CRC基因的干擾表達(dá)載體 pA6-CRCi。pA6-CRCi經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切驗(yàn)證，酶切圖譜中含有2.29 kb大小的CRC反向重復(fù)表達(dá)框片段(圖4)。表明CRC基因的干擾重復(fù)框已經(jīng)成功連接到帶pCAMBIA1390-35S雙元表達(dá)載體上。最終形成的pA6-CRCi載體含有1個(gè)由CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的CRC反向重復(fù)序列表達(dá)框，終止子是原載體自帶的nos終止子。

圖4 BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鑒定pA6-CRCiFig.4 Enzymatic identification of pA6-CRCi with BamHⅠand EcoRⅠ

3 討論

植物的雌性不育現(xiàn)象普遍存在，在水稻［5］、油松［6］、小麥［7］、甘藍(lán)型油菜［2］、大豆［8］和苜蓿［9］等十余種植物中均報(bào)道過(guò)雌性不育現(xiàn)象。導(dǎo)致植物雌性不育的原因比較復(fù)雜，而遠(yuǎn)緣雜交后代發(fā)現(xiàn)雌性不育的報(bào)道比較多。Stort［10］將蘭花的屬間或種間F1代與母本回交，發(fā)現(xiàn)其回交后代結(jié)實(shí)率下降，且雌性不育率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于雄性不育率。劉永勝等［11］觀察到水稻秈粳F(xiàn)1雜種的結(jié)實(shí)率僅為40% ～60%，其主要原因是由雌性不育引起。離體培養(yǎng)易產(chǎn)生無(wú)性系變異，也是產(chǎn)生雌性不育突變體的原因之一［5］。環(huán)境的變化也會(huì)影響植物的育性，Lillecrapp等［12］在Trevatt Blue的研究中發(fā)現(xiàn)，溫度可以影響到胚珠的數(shù)量，進(jìn)而形成多胚珠現(xiàn)象而導(dǎo)致雌性不育。

植物雌性不育的原因相當(dāng)復(fù)雜，一些表現(xiàn)為大孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂不正常，不能形成功能性大孢子。Rim［13］等研究發(fā)現(xiàn)豆科百脈根屬2個(gè)種的體細(xì)胞雜交后代由于大孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂后期發(fā)生異常，不能形成4個(gè)大孢子而導(dǎo)致雌性不育;也有的是因?yàn)椴荒苄纬沙墒斓呐吣遥?4］或胚珠發(fā)育異常而導(dǎo)致不結(jié)實(shí)［15］。此外，雌蕊發(fā)育異常，如多雌和雌蕊短小等突變現(xiàn)象，也會(huì)引起育性降低或不育［16］。近幾年來(lái)人們應(yīng)用遺傳學(xué)方法與分子生物學(xué)技術(shù)研究植物雌性不育的分子機(jī)理，發(fā)現(xiàn)了一些與雌性不育相關(guān)的基因。Lang等［17］研究證實(shí)，擬南芥sinl基因的突變會(huì)導(dǎo)致胚珠畸形發(fā)育與雌性不育的發(fā)生。Tian等［18］發(fā)現(xiàn)擬南芥中組蛋白脫乙?；?AtHD1)表達(dá)下調(diào)會(huì)導(dǎo)致許多異常現(xiàn)象產(chǎn)生，包括花器官缺陷及雌性和雄性不育。Capomaccio等［19］對(duì)紫花苜蓿雌性不育突變株和可育對(duì)照株雜交分離后代進(jìn)行了cDNA-AFLP擴(kuò)增分析，篩選并鑒定了3個(gè)與雌性不育性狀相關(guān)的基因MsBGluc、MsMAPKKK和MselF4G。

大多數(shù)植物的雌性不育在花的外觀特征上都有所表現(xiàn)。如Carapetian［20］等在紅花的雌性不育研究中觀察到2個(gè)紅花品種雜交產(chǎn)生的不育植株開(kāi)花時(shí)會(huì)發(fā)生小花的干枯和花柄的延長(zhǎng)。一些學(xué)者試圖從花器官發(fā)育調(diào)控方面去尋找雌性不育的內(nèi)在原因，其中花發(fā)育調(diào)控相關(guān)的一些轉(zhuǎn)錄因子受到人們的普遍關(guān)注，如YABBY家族的INNER NO OUTER(INO)參與了擬南芥胚珠的發(fā)育［21］;TONGARI-BOUSHI1(TOB1)參與了水稻小穗的發(fā)育［22］。而擬南芥CRABS CLAW(CRC)轉(zhuǎn)錄因子也屬于YABBY基因家族成員，是控制心皮發(fā)育的關(guān)鍵性基因，Alvarez等［23］報(bào)道CRC可抑制正在發(fā)育的雌蕊的橫向生長(zhǎng)，促進(jìn)其軸向生長(zhǎng)，CRC基因突變將引起雌蕊呈現(xiàn)較寬而短的結(jié)構(gòu)，且使兩心皮在頂點(diǎn)處呈非融合狀態(tài)，并導(dǎo)致蜜腺的缺失［24-25］。心皮發(fā)育還有SPT(SPATULA)基因［26-27］及花器官確定基因AGA(AGAMOUS)的參與［28］。從一些心皮突變體的研究中，首先認(rèn)為CRC基因很有可能是AGA調(diào)節(jié)的下游基因［25］。對(duì)分離到的2個(gè)突變基因CRC、SPT的研究發(fā)現(xiàn)，二者除了影響雌蕊的發(fā)育之外還導(dǎo)致其他不同的生理缺陷，通過(guò)對(duì)CRC、SPT和AGA以及其他的相關(guān)基因的詳細(xì)分析，發(fā)現(xiàn)CRC和SPT 2個(gè)基因都與心皮的發(fā)育有關(guān)，在心皮發(fā)育過(guò)程中CRC和SPT是與AGA平行起作用，而不是位于AGA的下游。

FS-M1突變體是研究甘藍(lán)型油菜柱頭發(fā)育分子機(jī)理的理想材料。李春宏等［4］基于蛋白質(zhì)組學(xué)水平比較甘藍(lán)型油菜野生型和FS-M1的柱頭差異蛋白質(zhì)，獲得了甘藍(lán)型油菜野生型柱頭顯著上調(diào)且可鑒定的蛋白質(zhì)有33個(gè)，包括抗脅迫/防御、氧化還原反應(yīng)平衡調(diào)節(jié)、碳水化合物代謝、蛋白質(zhì)水解、蛋白折疊、氨基酸和氮代謝、核苷酸代謝等7類(lèi)功能蛋白。李春宏等［29］以FS-M1突變體和其野生型為材料利用油菜基因表達(dá)譜芯片篩選甘藍(lán)型油菜柱頭特異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)野生型較FS-M1顯著上調(diào)的基因多達(dá)198個(gè)，主要是水解酶基因、轉(zhuǎn)移酶基因、氧化還原酶基因和轉(zhuǎn)錄因子中。但目前尚沒(méi)有詳實(shí)的證據(jù)闡明油菜突變體FS-M1雌性不育的原因。

我們對(duì)油菜雌性不育突變體FS-M1初步研究發(fā)現(xiàn)，其CRC基因表達(dá)水平較野生型對(duì)照極顯著下調(diào)，結(jié)合先前的研究報(bào)道FS-M1突變體柱頭短小且異常，因此我們推測(cè)油菜CRC基因下調(diào)可能是油菜雌性不育突變體FS-M1的內(nèi)在原因。為此，我們構(gòu)建了CRC基因的RNAi干擾載體，以期通過(guò)下調(diào)CRC表達(dá)，驗(yàn)證其在FS-M1突變體中所起的作用。本研究利用同源序列法通過(guò)PCR擴(kuò)增克隆了油菜CRC基因序列，經(jīng)過(guò)與已知序列進(jìn)行比對(duì)分析，證明本試驗(yàn)所克隆的基因序列正是甘藍(lán)型油菜的CRC基因序列。我們利用 pHurricane載體構(gòu)建CRC反向重復(fù)序列表達(dá)框，該表達(dá)框有1個(gè)擬南芥的FAD2基因的可剪切的內(nèi)含子序列，兩邊有多個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)可供選擇。將CRC基因片段分別插入該載體的Not I和Xho I位點(diǎn)，結(jié)合內(nèi)含子序列設(shè)計(jì)的引物，可以比較方便地選擇片段插入的方向。應(yīng)用該載體我們成功構(gòu)建了多個(gè)基因的干擾載體［30-31］。在本研究中我們選擇了增強(qiáng)型的CaMV35S啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子全長(zhǎng)序列780 bp左右，5'端有一段重復(fù)序列，可以起到增強(qiáng)表達(dá)的作用，用該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)CRC的反向重復(fù)序列表達(dá)框，目的是提高組成型表達(dá)的強(qiáng)度，達(dá)到徹底抑制CRC表達(dá)的效果。本試驗(yàn)成功構(gòu)建組成型表達(dá)的CRC基因干擾載體，經(jīng)過(guò)酶切驗(yàn)證和序列分析，表明所構(gòu)建的載體正確，這為進(jìn)一步開(kāi)展農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化油菜奠定了基礎(chǔ)。

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