運用農(nóng)桿菌介導的針刺法將外源基因轉(zhuǎn)入水稻

顏文飛， 張啟軍， 秦海龍， 廖慧敏， 宗壽余， 夏士健， 呂川根

(1.南京農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，江蘇 南京 210095;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所/江蘇省優(yōu)質(zhì)水稻工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京210014)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)作為一種可持續(xù)發(fā)展方式，可提高農(nóng)作物產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性等，具有良好的發(fā)展前景，將為農(nóng)業(yè)發(fā)展注入新的動力［1］。目前，在水稻育種上相繼開發(fā)研究的轉(zhuǎn)基因技術(shù)有以農(nóng)桿菌為主導的載體介導轉(zhuǎn)基因技術(shù)，以基因槍、PEG等介導的基因直接導入技術(shù)和以花粉管通道轉(zhuǎn)化、生殖細胞浸泡吸收為主的種質(zhì)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化技術(shù)，其中農(nóng)桿菌介導技術(shù)約占 64%［2］。

農(nóng)桿菌細胞內(nèi)的Ti質(zhì)?；騌i質(zhì)粒具有一段T-DNA，可通過農(nóng)桿菌侵染植物傷口進入細胞，并插入到植物基因組中。通過將目的基因插入到經(jīng)過改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染，可實現(xiàn)外源基因向植物細胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過細胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株［3］。自從1978年 Chilton等［4］第1次利用農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒為載體將T-DNA上的胭脂堿基因轉(zhuǎn)入煙草細胞以來，農(nóng)桿菌介導法在雙子葉植物轉(zhuǎn)化中得到了廣泛應用。1986年，Baba等［5］通過PEG法將農(nóng)桿菌原生質(zhì)球與水稻原生質(zhì)體融合，獲得了能合成胭脂堿的水稻轉(zhuǎn)化組織。之后，科學界開始對農(nóng)桿菌介導的水稻轉(zhuǎn)化技術(shù)進行廣泛的研究，試圖通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高水稻產(chǎn)量、改良品質(zhì)和增強抗性［6-8］。但是，由于國內(nèi)外不同實驗室使用的基因型、受體植體的不同和培養(yǎng)條件的差異，各個轉(zhuǎn)化體系得到的結(jié)果不盡相同，轉(zhuǎn)化率也普遍不高。所以，研究人員分別從Ti質(zhì)粒的改造、轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建和組織培養(yǎng)等方面入手，不斷優(yōu)化農(nóng)桿菌介導的水稻轉(zhuǎn)化方法，以期提高轉(zhuǎn)化效率。

經(jīng)過近20多年的發(fā)展和優(yōu)化，農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)基因技術(shù)的轉(zhuǎn)化效率得到了長足的提高，但與現(xiàn)代農(nóng)業(yè)對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的需求相比，其步伐仍然不夠快，仍存在許多障礙和安全隱患，需進一步加強轉(zhuǎn)化技術(shù)的研發(fā)，突破核心技術(shù)。

利用植物生長點轉(zhuǎn)化的原理是外源DNA通過細胞間隙進入莖尖生長點細胞部位，并轉(zhuǎn)化生長點細胞，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因后代。近年來，已有一些關于植物生長點用于轉(zhuǎn)化的報道，主要是在小麥、玉米上。1996年，杜立群等［9］用小麥的生長點作為外源基因的直接受體，利用基因槍轟擊獲得轉(zhuǎn)基因小麥。2005年，Razzaq等［10］以小麥為材料，嘗試了一種對生長點直接進行轉(zhuǎn)化的方法，并初步證明了這一方法的可行性。2009年，董福雙等［11］以小麥品種石4185為對象，建立了受體制備方法，初步建立了基因槍法轉(zhuǎn)化小麥種子芽生長點的技術(shù)。2011年，孫傳波等［12］以玉米自交系鄭58的莖尖為受體，通過農(nóng)桿菌介導法將抗草甘膦EPSPS基因轉(zhuǎn)入玉米，初步證明外源基因已經(jīng)整合到玉米基因組中，以玉米莖尖作為受體的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)可行、高效。在水稻上，2001年，林擁軍利用農(nóng)桿菌浸種法將反義Wx基因?qū)胨酒贩N珍汕 97B［13］。2005 年，Putu 等［14］利用農(nóng)桿菌介導直接侵染粳稻品種越光胚芽生長點也獲得轉(zhuǎn)基因植株。

本研究將沾有外源基因的農(nóng)桿菌菌液的接種針直接刺破侵染受體水稻的胚芽生長點，完成轉(zhuǎn)基因操作，而不需誘導愈傷組織以及之后的一系列組織培養(yǎng)過程，為轉(zhuǎn)化水稻提供一種簡單、快速、高效的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 受體水稻品種 水稻(Oryza sativa L.)品種南粳45由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所仲維功研究員提供。南粳45于2009年通過江蘇省品種審定委員會審定，為江蘇省主栽品種，并被農(nóng)業(yè)部列為超級稻推廣品種。

1.1.2 載體和菌株 農(nóng)桿菌菌株LBA4404含轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pBI121-GUS，含GUS基因(圖1)，由南京曉莊學院蔡小寧教授饋贈。

圖1 質(zhì)粒PBⅠ121-GUS結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structure diagram of plasmid PBⅠ121-GUS

1.1.3 試劑 BU-Taq酶、dNTP、Taq Buffer、質(zhì)粒提取試劑盒均購自南京天為生物科技有限公司，DNA分子量標準購自天根生化科技(北京)有限公司。卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)、頭孢霉素(Cef)、乙酰丁香酮(As)為Simga公司產(chǎn)品。X-Gluc、DMF為Biosharp公司產(chǎn)品。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。引物(表1)由上海英駿公司合成。

1.1.4 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基(用于培養(yǎng)農(nóng)桿菌):酵母提取物5 g/L，胰化蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0(固體培養(yǎng)基+瓊脂15 g/L)。

表1 基因位點或連鎖標記的引物序列Table 1 Primer sequence of gene or linkage markers

1.2 方法

1.2.1 水稻胚生長的觀察 將南粳45種子浸沒在含清水的培養(yǎng)皿里，在24℃下培養(yǎng)。每天分別挑取3～4粒種子，用解剖刀解剖后，在顯微鏡下觀察胚的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，確定胚芽生長點的大體位置，共觀察14 d。

1.2.2 植物表達載體農(nóng)桿菌的培養(yǎng)與檢測

1.2.2.1 植物表達載體農(nóng)桿菌的培養(yǎng) 取農(nóng)桿菌LBA4404菌液(帶有轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pBI121-GUS)200 μl于1.5 ml離心管中，用接種環(huán)進行平板劃線(Kan，50 μg/ml;Rif，50 μg/ml)，28 ℃倒置培養(yǎng) 48 h，挑選單菌落接種于10 ml的LB液體培養(yǎng)基中(含50 mg/L Rif和50 mg/L Kan)，28 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

取培養(yǎng)好的檢測有陽性質(zhì)粒的上述菌液1 ml，放至100 ml液體LB培養(yǎng)基(含100 μmol/L As)中擴大培養(yǎng)，28℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.3。為了便于觀察和使農(nóng)桿菌生長狀態(tài)良好，擴大培養(yǎng)液里不加抗生素。

1.2.2.2 植物表達載體農(nóng)桿菌陰陽性的檢測 按照Biomiga Ezgene公司生產(chǎn)的Plasmid Miniprep Kit試劑盒的使用說明書進行質(zhì)粒DNA的微量提取。PCR 擴增體系:10× PCR buffer 2.0 μl，dNTP(2 mmol/L)2.0 μl，Primer(2 mmol/L)2 μl，Taq DNA聚合酶 1 U，質(zhì)粒 DNA 2.0 μl，補充超純水至 20 μl。

PCR擴增程序為:94℃、5 min;94℃、30 s，57℃、30 s，72 ℃、50 s，35 個循環(huán);72 ℃、10 min。擴增產(chǎn)物加指示劑后用1%的瓊脂糖凝膠進行1 h的110 V電泳后照相。選取PCR擴增結(jié)果為陽性的菌液進行擴大培養(yǎng)。

1.2.3 水稻的遺傳轉(zhuǎn)化 以下操作均需在無菌條件下進行。

1.2.3.1 水稻種子的培養(yǎng) 將未去穎殼的南粳45種子先用75%的乙醇浸泡5 min，再用0.1%的升汞殺菌15～20 min，無菌水沖洗 3～4次。用無菌鑷子將消毒后的種子放在鋪有1層濾紙、盛有10 ml無菌水的培養(yǎng)皿中，每皿15粒，26～28℃培養(yǎng)1～2 d，直至種子微露白。

1.2.3.2 農(nóng)桿菌侵染水稻種胚 用沾有擴大培養(yǎng)后的農(nóng)桿菌菌液的接種針刺入水稻種胚，然后將種子放入植物培養(yǎng)瓶中(內(nèi)有2 cm厚的蛭石，蛭石上鋪有1張濕潤的濾紙)，每瓶15粒，22～24℃暗培養(yǎng)9～14 d，共侵染90粒。

1.2.3.3 水稻轉(zhuǎn)化苗的殺菌與移苗 將暗培養(yǎng)后苗長為10 cm左右的轉(zhuǎn)化苗浸泡在濃度為1 mg/ml的Cef溶液中1 h，之后，將苗移栽到網(wǎng)室中的盆缽中，盆缽直徑30 cm，每盆5苗。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因苗的DNA檢測 待處理后的苗長至7～8葉、株高40 cm以上時，每株取200 mg左右嫩葉進行DNA檢測，以正常南粳45秧苗為陰性對照。用SDS法從水稻新鮮葉片中微量提取總DNA。以正常南粳45秧苗為陰性對照，上述質(zhì)粒DNA檢測為陽性的質(zhì)粒DNA為陽性對照，以水稻基因組DNA為模板，以GUS基因的序列設計引物進行轉(zhuǎn)基因植株的PCR分析。

PCR 擴增體系:10 × PCR buffer 2.0 μl，dNTP(2 mmol/L)2.0 μl，Primer(2 mmol/L)2.0 μl，Taq DNA 聚合酶1 U，DNA 2.0 μl，補充超純水至20 μl。PCR 擴增程序為:94 ℃、5 min;94 ℃、30 s，57 ℃、30 s，72 ℃、54 s，35個循環(huán);72℃、10 min。擴增產(chǎn)物加指示劑后用1%的瓊脂糖凝膠進行1 h的110 V電泳后照相。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因苗GUS基因的組織化學檢測 對上述DNA檢測有GUS基因的水稻，每株取2張葉片，并取2張陰性對照水稻葉片，先用90%丙酮在-20℃浸泡至少2 h。將丙酮浸泡后的水稻葉片用無菌水沖洗后轉(zhuǎn)到已過濾除菌的X-Gluc染色液中，37℃水浴10 h。水浴后棄染色液，轉(zhuǎn)入 70%～100%乙醇中脫色2～3次，至陰性對照材料呈白色(室溫下)。肉眼或顯微鏡下觀察，具有GUS活性的部位或位點是否呈現(xiàn)藍色或藍色斑點。

1.2.6 T1代轉(zhuǎn)基因苗的培育和基因檢測 對T0代檢測有GUS基因的水稻苗，待其成熟后單株收獲種子，編號，包在扎有透氣孔的種子袋里，45℃下烘2 d。2 d后將種子拿出，待其溫度退到室溫時，隨機選取8個種子袋，將其泡在0.5%的升汞溶液中浸種24 h，然后經(jīng)清水沖洗，包在濕布里放在白熾燈管上催芽至露白，期間勤加水，保持布處于濕潤狀態(tài)。將催芽后的種子按編號播種在網(wǎng)室里，蓋上保溫膜，30 d后分群體取樣，進行DNA檢測和GUS組織化學檢測(方法同方法1.2.4和方法1.2.5)。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻胚的生長

經(jīng)過14 d的反復觀察，水稻胚的生長動態(tài)及胚芽胚根露出種孔后的大致位置如圖2e:胚根位于種孔的中上部，胚芽位于種孔的中下部，二者生長后期呈45°～180°，這使我們明確了進行下一步侵染轉(zhuǎn)化時針刺生長點的大致位置。

圖2a:胚尚未露出種孔，胚的形態(tài)結(jié)構(gòu)尚未清晰;圖2b:胚已微露出種孔，胚芽胚根已可區(qū)分;圖2c:胚微露出種孔，胚芽胚根形態(tài)結(jié)構(gòu)分明;圖2d:胚已幾乎全露出種孔，胚芽胚根形態(tài)結(jié)構(gòu)分明，胚芽胚根分化明顯。由此我們確定，在水稻浸泡24～36 h，胚芽胚根已可區(qū)分但尚未完全分化時，進行轉(zhuǎn)基因的針刺侵染最為合適。

圖2 水稻胚的生長Fig.2 Growth of rice embryo

2.2 侵染轉(zhuǎn)化后的秧苗生長

侵染轉(zhuǎn)化后的秧苗生長見圖3，待轉(zhuǎn)化苗長至10 cm左右，用Cef溶液進行殺菌消毒后轉(zhuǎn)至網(wǎng)室盆栽。其中侵染了90粒南粳45種子，成苗48株，成苗率達53.3%。

2.3 轉(zhuǎn)基因T0代的PCR檢測

對48棵T0代轉(zhuǎn)化植株進行PCR檢測，凝膠電泳顯像結(jié)果中，由于有些DNA擴增條帶較模糊，本試驗把它們歸為陰性植株。保守確定，PCR檢測中有16棵植株擴增條帶為陽性(圖4)，轉(zhuǎn)化率達33.3%，初步證實GUS基因已導入水稻基因組中。

2.4 轉(zhuǎn)基因T0代GUS基因的組織化學檢測

取未針刺轉(zhuǎn)化的南粳45葉片2張作陰性對照(CK)，對于上述DNA檢測為陽性的水稻，每個單株取2張葉片，共34張葉片，進行GUS基因的組織化學檢測。經(jīng)酒精脫色后對照呈白化顏色，而32張轉(zhuǎn)GUS陽性T0代葉片均有不同程度的藍色斑點顯現(xiàn)(圖5)，再次驗證了GUS基因已導入南粳45基因組中，并在蛋白質(zhì)水平上表達。

圖3 侵染轉(zhuǎn)化后水稻苗的生長Fig.3 Growth of rice after genetic transformation

圖4 轉(zhuǎn)基因T0代植株的PCR檢測Fig.4 PCR assays of T0transgenic plants

圖5 部分轉(zhuǎn)基因T0代植株GUS基因的組織化學檢測Fig.5 Histochemical assay of GUS gene in some T0transgenic plants

2.5 轉(zhuǎn)基因T1代的PCR檢測

對8個T1代轉(zhuǎn)基因群體進行PCR檢測，發(fā)現(xiàn)其中4個T1代群體中99%植株可檢測到GUS基因，其群體植株總數(shù)分別為32株、37株、46株和15株。而其余4個T1代群體(植株總數(shù)分別為24株、64株、52株和66株)中，只有部分植株檢測到GUS基因，呈分離現(xiàn)象，陽性植株與陰性植株的分離比依次為 1.0∶3.0、1.0∶1.5、1.0∶2.4、1.0∶10.0。說明 GUS基因已從 T0代傳遞到T1代，但后代分離并不符合孟德爾遺傳分離比例。

2.6 轉(zhuǎn)基因T1代GUS基因的組織化學檢測

對種植的8個T1代群體均隨機在4株苗上各取1張葉片，陰性對照葉片2張，共34張葉片，進行GUS基因的組織化學染色檢測。結(jié)果如圖6，對照CK經(jīng)酒精脫色后呈白化顏色，而轉(zhuǎn)GUS陽性T1代苗經(jīng)酒精脫色后均顯藍色。進一步說明T1代植株中存在GUS基因，且已在蛋白質(zhì)水平上表達。

圖6 部分轉(zhuǎn)基因T1代植株GUS基因的組織化學檢測Fig.6 Histochemical assay of GUS gene in some T1transgenic plants

3 討論

本方法中南粳45 T0代轉(zhuǎn)化率保守達33.3%，即在生長成植株的48株中，16株經(jīng)PCR檢測和GUS基因的組織化學染色檢測均為陽性，說明外源基因不僅導入水稻基因組中，且已在蛋白質(zhì)水平上表達。利用愈傷進行遺傳轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化率表示的是基因檢測為陽性的抗性植株/進行共培養(yǎng)的愈傷總數(shù)。據(jù)不完全調(diào)查，近年來，對植株轉(zhuǎn)化成功率進行統(tǒng)計的結(jié)果有:1994年，Hiei等［15］實現(xiàn)對粳稻的高頻轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率達到28.6%;2003年，殷麗青等［16］以15個秈稻、粳稻栽培品種為材料，粳稻遺傳轉(zhuǎn)化頻率為3.9%～11.4%，秈稻遺傳轉(zhuǎn)化頻率為 0.2%～8.1%;2005年，劉元鳳等［17］對4個秈稻品種進行遺傳轉(zhuǎn)化，平均穩(wěn)定轉(zhuǎn)化率為23.6%;2005年，任永霞等［18］對植物遺傳轉(zhuǎn)化方法進行概述，統(tǒng)計出利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化粳稻和秈稻的遺傳轉(zhuǎn)化率分別為29.0%和22.0%;2007年，胡麗華等［19］利用農(nóng)桿菌介導法將檸檬酸合成酶基因?qū)攵i稻明恢86，獲得抗性植株轉(zhuǎn)化率為6.0%;2007年，寧約瑟等［7］在對農(nóng)桿菌介導水稻遺傳轉(zhuǎn)化研究進展中提到秈稻轉(zhuǎn)化較困難，多數(shù)秈稻轉(zhuǎn)化率不超過10.0%;2008年，劉永巍等［20］以粳稻品種空育131、墾鑒稻7號愈傷組織為材料進行遺傳轉(zhuǎn)化，平均轉(zhuǎn)化率僅為3.0%。

綜上所述，運用常規(guī)農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化水稻，粳稻的平均轉(zhuǎn)化率一般在3%～29%，秈稻的平均轉(zhuǎn)化率不高于10%。本研究方法獲得了較高的轉(zhuǎn)化效率，且導入的基因均已在蛋白質(zhì)水平上表達。而且，本方法不需誘導愈傷組織以及之后的一系列組織培養(yǎng)過程，即不需配制各種培養(yǎng)基、控制各種培養(yǎng)條件并對其不斷進行優(yōu)化調(diào)整。利用傳統(tǒng)農(nóng)桿菌介導法獲得轉(zhuǎn)基因植株的周期至少為2～4個月，而應用本方法只需10～15 d。本方法大大縮短培養(yǎng)周期，節(jié)省了大量的財力物力，簡化了農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法的流程，提高了轉(zhuǎn)化的工作效率。

對轉(zhuǎn)基因T1代進行PCR檢測發(fā)現(xiàn)，部分轉(zhuǎn)基因后代群體99%的個體為GUS陽性，而有4個轉(zhuǎn)基因后代群體發(fā)生基因分離，分離比并不符合孟德爾3∶1的分離比。根據(jù)前人轉(zhuǎn)基因遺傳研究的結(jié)果，外源基因一般作為1個顯性基因傳遞給后代，遵循孟德爾遺傳分離規(guī)律，自交結(jié)實后代表現(xiàn)3∶1分離比例，與非轉(zhuǎn)化親本雜交后代表現(xiàn) 1∶1分離比［21］。

對于后代群體發(fā)生分離但又不符合孟德爾式遺傳規(guī)律的現(xiàn)象，猜想其原因可能有2個，一是由于轉(zhuǎn)化針刺生長點的位置不夠精確，使得轉(zhuǎn)化受體為嵌合體，所以其后代不符合3∶1的分離比。二是TDNA多拷貝地整合到宿主染色體中或部分單株轉(zhuǎn)入基因丟失等。對于這2種情況，可行的解決辦法是，利用Southern印跡選擇單拷貝植株，繁殖至高世代，直到獲得目標基因純合的株系。

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