微波輔助萃取-氣相色譜法同時(shí)測定皮革及其制品中21種有害有機(jī)溶劑殘留量

王成云，施欽元，鄔曉慧，林鐿琳，沈雅蕾，褚乃清

(深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局工業(yè)品檢測技術(shù)中心，廣東深圳518067)

1 引言

酰胺類溶劑、乙二醇醚類溶劑和N-甲基吡咯烷酮 (NMP)均具有優(yōu)異的溶解性能，在皮革工業(yè)中作為溶劑廣泛使用[1-3]，但是，這些有機(jī)溶劑可能會殘留在最終產(chǎn)品中，給消費(fèi)者帶來潛在的危險(xiǎn)。隨著這幾類有機(jī)溶劑的大規(guī)模使用，其在使用過程中造成的職業(yè)性暴露及其對使用者造成的危害也不容忽視。隨著科技的進(jìn)步和生活水平的提高，人們越來越關(guān)注涉及人體健康的化學(xué)品的使用。為確定這些有機(jī)溶劑的毒性，人們進(jìn)行了大量研究[4-6]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NMP、部分酰胺類溶劑和部分乙二醇醚類溶劑均能致癌、致畸變，為此各國紛紛立法加以限制，被限制使用的有害有機(jī)溶劑種類不斷增加。歐盟先后發(fā)布指令97/56/EC、36/2003/EC、1348/2008/EC、2009/6/EC、48/2009/EC、552/2009/EC，限制使用 DEGBE、DEGDME、DEGME、DMA、DMF、EGBE、EGDEE、EGDME、EGEE、EGME、MA、MF、NMP、TEGDME、甲酰胺等15種有機(jī)溶劑，歐洲化學(xué)品管理局更是將DEGDME、DMA、DMF、EGDEE、EGDME、EGEE、EGME、MA、NMP、TEGDME、甲酰胺等11種有機(jī)溶劑列入高關(guān)注物質(zhì) (SVHC)清單。本文對21種有害有機(jī)溶劑進(jìn)行了研究，表1給出了相關(guān)的信息。

國外對這些有害有機(jī)溶劑的嚴(yán)厲限制給我國皮革及其制品的出口設(shè)置了一道新的技術(shù)貿(mào)易壁壘，建立1個(gè)能同時(shí)測定包含上述15種限用有機(jī)溶劑在內(nèi)的多種有害有機(jī)溶劑含量的分析方法，具有十分重要的意義。關(guān)于上述3類有害有機(jī)溶劑含量的測定，已有大量文獻(xiàn)報(bào)道[7-15]，但這些文獻(xiàn)報(bào)道的測定對象均未全部涵蓋上述15種限用有機(jī)溶劑。本文以甲醇為萃取溶劑，采用微波輔助萃取技術(shù)提取皮革及其制品中殘留的有害有機(jī)溶劑，用硅膠固相萃取柱對提取液進(jìn)行凈化，然后進(jìn)行氣相色譜-火焰離子化檢測器 (GC-FID)分析，建立了1個(gè)能同時(shí)測定皮革及其制品中21種有害有機(jī)溶劑含量的氣相色譜方法，并應(yīng)用該方法對市售皮革及其制品中有害有機(jī)溶劑的殘留量進(jìn)行了測定。

表1 21種有害有機(jī)溶劑

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Agilent 7890B-5977A氣質(zhì)聯(lián)用儀 (美國Agilent公司，配FID檢測器);ETHOS 1微波萃取儀 (意大利Milestone公司);Retch SM2000織物研磨儀 (德國Retch公司);Heidolph 4003旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (德國 Heidolph公司);0.22 μm濾膜(德國Membrane公司);氮吹儀 (北京康林科技有限責(zé)任公司);硅膠固相萃取柱 (美國Waters公司，1g/6mL)。

色譜純甲醇由美國Merck公司提供;標(biāo)準(zhǔn)品均由德國Dr.Ehrenstorfer公司提供，首先用甲醇配制質(zhì)量濃度約為2000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再各取適量體積的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇配制混標(biāo)儲備液，混標(biāo)儲備液中各組分的濃度見表1。使用時(shí)再用甲醇逐級稀釋，配制系列混標(biāo)工作液。分析純試劑甲醇、乙醇、乙醚、乙酸乙酯、乙腈、丙酮、叔丁基甲醚、正己烷、二氯甲烷、四氫呋喃、石油醚均由廣州化學(xué)試劑廠提供。

自制陽性樣品:黑色牛皮革，采用浸漬-烘干-焙烘工藝制備，含有 EGDME、EGDEE、DEGDME、EGDBE、DEGDEE、NMP等6種目標(biāo)分析物。

2.2 樣品前處理

將待測樣品用織物研磨儀磨成粉末，混勻后取約1.0 g樣品，置于微波萃取管中，加入17mL甲醇，在85℃下微波輔助萃取30 min，冷卻至室溫，過濾，將濾液真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約5mL，轉(zhuǎn)移至已用5mL甲醇進(jìn)行預(yù)活化處理的硅膠固相萃取柱中，使其緩慢流出，控制流出速度為2滴/秒，收集流出液。用5mL甲醇分3次淋洗固相萃取柱，繼續(xù)收集流出液。流出液真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干后，轉(zhuǎn)移到氮吹儀中，用干燥氮?dú)鈱⑵渚徛蹈?，殘留物?mL甲醇溶解，所得溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后直接進(jìn)行GC-FID分析，外標(biāo)法定量。必要時(shí)，先進(jìn)行適當(dāng)稀釋。

2.3 分析條件

DB-Wax 色譜柱 (60m 0.25mm 0.25μm)，升溫程序:起始溫度60℃，保持5 min，以20℃/min的速度升至220℃，保持10 min。后處理時(shí)間3 min，后處理溫度245℃。進(jìn)樣量1.0μL，不分流進(jìn)樣，0.75 min后開閥。載氣為氮?dú)猓魉贋?.0mL/min，氫氣流量30mL/min，空氣流量400mL/min。進(jìn)樣口溫度240℃，檢測器溫度250℃，傳輸線溫度280℃。

3 結(jié)果與討論

3.1 凈化條件的優(yōu)化

皮革及其制品的基質(zhì)十分復(fù)雜，采用微波輔助萃取技術(shù)提取其中的目標(biāo)分析物時(shí)，大量伴生雜質(zhì)也同時(shí)被萃取出來，對目標(biāo)分析物的測定造成十分嚴(yán)重的干擾，需要對提取液先進(jìn)行凈化處理后才能進(jìn)行儀器分析[16]。固相萃取柱凈化技術(shù)集富集、分離、凈化功能于一體，常用于皮革樣品的凈化。該技術(shù)的核心是填料，不同填料的極性和吸附原理各不相同，對目標(biāo)分析物的凈化效果相差極大。固相萃取柱的容量、洗脫液種類及體積、洗脫速度均對凈化效果有一定影響。在凈化過程中，雜質(zhì)吸附在固相萃取柱上，目標(biāo)分析物則大部分被洗脫下來，但也有部分目標(biāo)分析物被吸附在固相萃取柱上，造成目標(biāo)分析物的損失。因此在選擇固相萃取柱時(shí)，必須同時(shí)考慮萃取柱的凈化能力和目標(biāo)分析物的損失。NMP、乙二醇醚類溶劑、酰胺類溶劑均具有較強(qiáng)的極性，為獲得較好的凈化效果，應(yīng)選用填料極性較強(qiáng)的固相萃取柱，并用較強(qiáng)極性的洗脫液進(jìn)行洗脫。以不含目標(biāo)分析物的豬皮革、牛皮革和羊皮革提取液為空白基質(zhì)，各加入1mL混標(biāo)，作為實(shí)際樣品提取液。同時(shí)考察了AccuBond Florisil PR柱(0.5g/3mL)、Agilent Bond Elut Al-N 柱 (0.5g/3mL)、Supelclean ENVI-18 SPE 柱 (0.5g/3mL)、Supelclean LCC18柱 (0.5g/3mL)、Supelclean LC-Ph SPE 柱 (0.5g/3mL)、Varian Bond Elut SCX 柱 (0.5g/3mL)、Waters Sep-Pak Vac柱 (0.5g/3mL)、Agilent Bond Elut C18柱 (1g/6mL)、Agilent Bond Elut Si柱 (1g/6mL)、Anpelclean PA SPE柱 (1g/6mL)、CNWBond LC-C18柱 (1g/6mL)、Supelclean LC-C18SPE柱 (1g/6mL)、Supelclean LC-Florisil SPE柱 (1g/6mL)、Supelclean LC-Si SPE柱 (1g/6mL)、Waters Sep-Pak Vac Silica柱 (1g/6mL)、Varian HF Bond Elut C18柱 (2g/12mL)等16種不同填料、不同容量的固相萃取柱對混標(biāo)和上述3種實(shí)際樣品提取液的處理效果，并與未經(jīng)固相萃取柱處理的混標(biāo)進(jìn)行對比，計(jì)算各組分的回收率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Waters Sep-Pak Vac Silica柱 (1g/6mL)的凈化效果最好，對混標(biāo)的回收率為92.3% ～101.3%，對3種實(shí)際樣品的回收率為87.1% ～92.5%，均遠(yuǎn)好于其他15種固相萃取柱。分別考察了固相萃取柱容量 (0.5g/3mL、1g/6mL)、洗脫液 (甲醇、乙腈、丙酮、乙醇、四氫呋喃)、洗脫速度 (1、2、3、4滴/秒)、洗脫液體積 (5、10、15、20mL)等因素對凈化效果的影響，洗脫條件最終優(yōu)化為:萃取柱為Waters Sep-Pak Vac Silica柱 (1g/6mL)，以5mL甲醇為洗脫溶劑，洗脫速度為2滴/秒。

3.2 萃取條件的優(yōu)化

微波輔助萃取的效率取決于所用萃取溶劑、萃取時(shí)間、萃取溫度、萃取壓力，較長的萃取時(shí)間、較高的萃取壓力、較高的萃取溫度均有利于提高萃取效率，但最關(guān)鍵的因素是萃取溶劑。通常情況下，萃取溫度設(shè)定為比溶劑沸點(diǎn)高10～20℃，萃取溶劑體積則一般為萃取管總體積的1/3，因此對于每種萃取溶劑，一旦其萃取溫度確定，萃取壓力也隨之而定。萃取溫度和萃取壓力的上限受制于萃取管材質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)所用萃取管材質(zhì)為聚四氟乙烯，可承受260℃的高溫和50個(gè)大氣壓的高壓。通常所用溶劑沸點(diǎn)均不超過150℃，萃取管內(nèi)壓力均不超過20個(gè)大氣壓。因此，為盡可能地提供萃取效率，可將萃取溫度設(shè)定為比溶劑沸點(diǎn)高20℃。通常情況下，微波萃取時(shí)間超過15 min時(shí)，萃取效果就可得到保證，萃取時(shí)間繼續(xù)增加時(shí)，萃取效率基本無變化。為了保證萃取效果，本文萃取時(shí)間選定為30 min。

溶劑的微波吸收特性、溶劑與基質(zhì)間的相互作用和目標(biāo)分析物在溶劑中的溶解度均直接影響溶劑的微波萃取效果，采用不同溶劑作為微波萃取溶劑，微波萃取效率相差極大。分別以甲醇、乙醚、乙醇、乙酸乙酯、乙腈、乙酸乙酯/二氯甲烷 (1∶1，V/V)、丙酮、丙酮/正己烷 (1∶1，V/V)、叔丁基甲醚、二氯甲烷、四氫呋喃、石油醚等12種常見溶劑為萃取溶劑，對2個(gè)陽性樣品進(jìn)行微波萃取 (其中1#樣品為黑色羊皮革，含有DMF、DEGEE和DEGBE，2#樣品為自制 樣 品，含 有 DEGDEE、DEGDME、EGDBE、EGDEE、EGDME、NMP)，測定各組分的萃取量，計(jì)算2個(gè)樣品的總萃取量，以總萃取量判斷溶劑的萃取效果，結(jié)果見表2。從表2數(shù)據(jù)可以看出，對于同一樣品中的不同組分，最大萃取量對應(yīng)的溶劑各不相同。對于1#樣品，最佳溶劑是丙酮/正己烷 (1∶1)，其次是甲醇，對于2#樣品，最佳溶劑是甲醇，其次是乙酸乙酯/二氯甲烷 (1∶1)。對于2個(gè)樣品，甲醇或是最佳溶劑，或萃取效果接近最佳溶劑。綜合考慮，選擇甲醇作為萃取溶劑。

表2 不同溶劑的萃取效果 (mg/kg)

3.3 分析條件的優(yōu)化

不同色譜柱的固定相不同，由于被分離的組分在固定相和流動相中的分配系數(shù)不同，在色譜分離過程中，被分離的組分在固定相和流動相之間反復(fù)分配，最終實(shí)現(xiàn)各組分的分離，不同色譜柱的分離效果相差極大?？疾炝薍PInnowax(30 m(0.25mm(0.25 μm)、DB-5MS(60 m(0.25mm(0.25 μm)、DB-Wax(30 m(0.25mm(0.25 μm)、DB-Wax(60 m(0.25mm(0.25 μm)、DB-5HT(15 m(0.25mm(0.10 μm)、DB-624(30 m(0.25mm(1.4 μm)、DB-5MS(30 m(0.25mm(0.25μm)、DB-35MS(30 m(0.25mm(0.25 μm)等 8 種不同色譜柱對21種有害有機(jī)溶劑的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能將21種有害有機(jī)溶劑完全分離的色譜柱只有DB-Wax(60 m(0.25mm(0.25 μm)。

表3 正交實(shí)驗(yàn)

圖1 21種混標(biāo)的GC-FID圖峰號同表4

各組分的色譜峰面積取決于進(jìn)樣口溫度、檢測器溫度和載氣流速，在只考慮單一因素影響時(shí)，進(jìn)樣口溫度、檢測器溫度和載氣流速的最佳值分別為230℃、250℃和1.1mL，在此條件下，其總峰面積分別達(dá)到最大值。綜合考慮這3個(gè)因素對峰面積的影響，設(shè)計(jì)了表3所示的正交實(shí)驗(yàn)條件，測定每個(gè)條件下各組分的峰面積，并計(jì)算總峰面積，以總峰面積作為判斷依據(jù)。表3數(shù)據(jù)表明，條件4#時(shí)總峰面積最大。因此分析條件最終優(yōu)化如下:檢測器溫度250℃、進(jìn)樣口溫度240℃、載氣流速1.0mL/min。在此條件下，對混標(biāo)分析GC-FID分析，得到圖1，圖1中各組分間分離完全，譜峰對稱性好。

3.4 線性關(guān)系和檢測限

按上述分析條件對系列混標(biāo)工作液進(jìn)行測定，測定各組分的峰面積 (A)，用峰面積 (A)對其質(zhì)量濃度 (ρ)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于每個(gè)組分，峰面積 (A)在一定質(zhì)量濃度 (ρ)范圍內(nèi)均與其質(zhì)量濃度 (ρ)線性相關(guān)，表4給出了各組分的線性關(guān)系。檢出限 (LOD)按公式LOD=3Sb/b計(jì)算，其中Sb為空白值標(biāo)準(zhǔn)偏差，它通過20次平行測試得到，b為方法校準(zhǔn)曲線的斜率，各組分的檢出限為0.05 ～0.50 mg/kg。

表4 方法的線性關(guān)系和檢出限 (LOD)

表5 精密度實(shí)驗(yàn) (mg/kg)

3.5 回收率和精密度

方法的精密度通過對1個(gè)自制皮革陽性樣品 (該樣品中含 有 DEGDEE、 DEGDME、 EGDBE、 EGDEE、 EGDME、NMP)進(jìn)行9次平行樣測試而得到，結(jié)果見表5，各組分的精密度為1.76 ～4.18%。

以不含目標(biāo)分析物的牛二層皮為空白基質(zhì)，分別添加2倍LOD、10倍LOD、20倍LOD濃度水平的混標(biāo)，每個(gè)添加水平各制備9個(gè)平行樣，按上述方法進(jìn)行測定，計(jì)算各組分的回收率和平均回收率，結(jié)果表明，方法的平均回收率為81.65 ～95.84%。

3.6 實(shí)際樣品測試

應(yīng)用本文建立的方法對市售皮革及其制品中殘留的有害有機(jī)溶劑進(jìn)行測定，測試對象共512個(gè)，其中牛皮革樣品76個(gè)、豬皮革樣品32個(gè)、羊皮革樣品53個(gè)、牛皮革制品243個(gè)、豬皮革制品29個(gè)、羊皮革制品53個(gè)，在其中39個(gè)樣品中檢出了不同含量的目標(biāo)分析物，檢出組分共有DEGBE、DEGEE、EGBE、 EGEE、 TEGBE、 TEGME、 DMA、 DMF、NMP等9種，其中NMP、EGEE、DMA、DMF等4種有機(jī)溶劑屬于 SVHC物質(zhì)，NMP、EGEE、DMA、DMF、DEGBE、EGBE等6種有機(jī)溶劑屬于REACH法規(guī)限用物質(zhì)。各組分的檢出次數(shù)分別為5(DMA)、30(DMF)、39(DEGBE)、20(DEGEE)、16(EGBE)、16(EGEE)、10(NMP)、11(TEGBE)、1次 (TEGME)，檢出率分別為 1.5、5.9、7.6、3.9、3.1、3.1、2.0、2.1、0.2%。各組分檢出的含量為2.8 ～453.5 mg/kg，含量最高的是 DEGBE，達(dá)453.5 mg/kg，該數(shù)值雖低于REACH法規(guī)的限量值 (1000 mg/kg)，但應(yīng)引起足夠重視。圖2是1個(gè)黑色羊皮革樣品的GC-FID圖，該樣品中檢出了 DMF、DEGBE和 DEGEE，其含量分別為60.5、17.2、15.6 mg/kg。

圖2 實(shí)際樣品的GC-FID圖

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