心血管疾病標志物的新秀:循環(huán)microRNA

心血管疾病是西方國家患病率和病死率第一位的疾病。現(xiàn)在已有證據(jù)證實microRNAs（miRNA）是調節(jié)包括心血管疾病在內的許多疾病的關鍵調節(jié)因子。最近發(fā)現(xiàn)，通過不同的載體，miRNA可以傳輸至細胞外，這一發(fā)現(xiàn)再次激起了國內外學者的研究熱情，通過檢測循環(huán)中的miRNA可以提供疾病診斷及治療的信息。與傳統(tǒng)的生物標志物相比，循環(huán)miRNA有顯著的優(yōu)越性，這種存在于細胞外的miRNA已被證明能在循環(huán)血液中穩(wěn)定存在，因此檢測循環(huán)血液中的miRNA成為可能。盡管部分miRNA精確的細胞來源還不十分確定，但前期的研究已經(jīng)證明了miRNA能作用于受體細胞，并調節(jié)靶基因的轉錄并影響蛋白的合成。許多miRNA的表達是細胞或組織特異性的，而它們的表達水平也與相應組織或細胞的病理或生理過程有關，異常的表達反應了機體的病理狀態(tài)。因此循環(huán)miRNA作為一種新的疾病標志物得到了越來越多的重視。在正常人和腫瘤等疾病患者體內循環(huán)miRNA的表達譜存在明顯的差異，因次，循環(huán)miRNA很可能成為診斷疾病的非侵入的、準確的新型生物標志物，有廣闊的前景。本綜述將首先討論循環(huán)miRNA，作為存在于細胞外的核酸，在循環(huán)血液中是如何穩(wěn)定存在并發(fā)揮調節(jié)作用的。其次總結循環(huán)miRNA作為新型標志物在心血管及相關領域的最新進展，包括：心肌梗死[1]，心力衰竭[2]，動脈粥樣硬化[3]和高血壓[4]等。

1miRNA的發(fā)現(xiàn)

1972年首次在血漿中發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)定存在的細胞外完整的RNA，這種RNA不被RNA酶降解。這種細胞外的RNA，包括miRNA一定有種保護機制能對抗降解。這是miRNA首次被發(fā)現(xiàn)，但當時并未意識到這種miRNA的重要作用。

大約10年前，在哺乳動物體內發(fā)現(xiàn)了一組非編碼的小RNA[5]，在進化上相對保守。miRNAs作用于mRNA的3'非編碼區(qū)在轉錄后水平調節(jié)基因表達。通過影響蛋白質的翻譯，miRNAs在生物合成過程中起重要的調節(jié)作用。循環(huán)miRNA的意外發(fā)現(xiàn)開啟了研究領域的新篇章，使得我們有機會深入了解這一極為活躍的生物標志物，miRNA及時將細胞內的信息傳遞給我們。意識到miRNA重要的調節(jié)作用后，很快掀起了miRNA的研究熱潮，在心血管領域的研究也是持續(xù)升溫。miRNA作為心血管疾病的標志物和治療手段成為研究的熱點[6]。

2循環(huán)MiRNA的穩(wěn)定性

2008年，miRNA的研究取得重大突破，Lawrie等[7]于2008年首次在淋巴瘤患者的血清中發(fā)現(xiàn)了細胞外的miRNA。同年，Mitchell 等[8]在前列腺癌患者的血清及血漿中都發(fā)現(xiàn)了這種生物標志物。隨后，多項研究證實了miRNA可以由細胞輸出至胞外，在體液中穩(wěn)定存在，包括血漿、血清、唾液、尿液、淚液甚至乳汁[9-11]。通過血漿、紅細胞、血小板、及有核細胞的檢測發(fā)現(xiàn)血漿miRNA能穩(wěn)定存在，即使在各種嚴苛的條件下：高溫至沸騰，強酸強堿，室溫下長期儲存和反復凍融等[7，8，12]。已知細胞外裸露的RNA極易被RNA酶降解，而miRNA卻出奇的穩(wěn)定，這說明內生的miRNA必然受到某種機制的保護而不被降解。研究證實miRNAs在血漿中被有膜微顆粒包裹如胞外體、微囊泡和凋亡小體[13，14]或與RNA結合蛋白結合（如Argonaute2，Ago2蛋白)[15]或者結合于載脂蛋白復合體（如high-density lipoprotein ，HDL)[16]通過這些方式的結合阻止降解。

3循環(huán)miRNA的來源

El-Hefnawy等[17]首次提出血漿RNA通過包裹于蛋白或脂質囊泡中而逃過RNA酶的降解。根據(jù)他們的體積及從細胞中釋放的方式，這些顆粒被分別命名為胞外體，微囊泡或凋亡小體。胞外體直徑50~100nm，前體又稱胞內體，胞內體內含有由細胞核釋放的miRNA， 多個胞內體在胞漿中形成多囊復合體，但各自有獨立的包膜包裹，當多囊復合體的膜與細胞膜融合時，這些小泡釋放至胞外形成了胞外體。微囊泡或脫落的微囊泡是另一種形式的帶膜微粒[18]，是細胞質膜脫落的產(chǎn)物，和胞外體一樣，微囊泡也可以來源于不同的細胞 [19]，直徑0.1~1μm，大于胞外體。兩種帶膜微粒的產(chǎn)生機制也不相同[20，21]。胞外體的形成是細胞的內吞作用，并將內吞的囊泡融合成多囊泡（MVBs），而微囊泡的形成是細胞自身的出牙過程[22]。Hunter 等于2008年首次在微囊泡中發(fā)現(xiàn)了miRNA[23]，攜帶有miRNA的微囊泡同樣能作用于受體細胞起到信息傳遞的作用。含有miRNA的微囊泡在細胞凋亡時即可形成凋亡小體，細胞壞死或凋亡時這種有膜結構的囊泡攜帶miRNA進入血循環(huán)[22]。 機體內富含各種形狀，大小（1~5μm）的微粒[24]。

除了細胞起源的囊泡包裹有miRNA，還有很大一部分細胞外的miRNA并不是存在有膜結構中，而是與蛋白結合，其中包括核仁磷酸蛋白（nucleophosmin，NPM1）[25]， Ago蛋白家族的Ago2，還有Ago1， Ago3 ，Ago4。最近有報道細胞外的miRNA還可以通過高密度脂蛋白轉運[26，27]，可見細胞內miRNA的載體非常豐富，通過結合載體miRNA能在血漿微粒中穩(wěn)定存在，越來越多的證據(jù)顯示這種血漿中的miRNA并不單純是被動的釋放，而是在細胞與細胞之間發(fā)揮重要的信息傳遞的功能，miRNA微粒通過血液循環(huán)作用于遠處的靶細胞，并實現(xiàn)對靶細胞基因表達的調節(jié)[28，29]。見圖1。

圖1循環(huán)miRNA的釋放及細胞間的傳遞

圖1在細胞核內，在RNA聚合酶Ⅱ（polymeraseⅡ，PolⅡ）的作用下生成具有莖環(huán)結構的miRNA的前體（primary miRNA，Pri-miRNA）。Pri-miRNA輸出至胞漿中，被Dicer核酸酶切割成雙鏈miRNA。miRNA雙鏈解離形成成熟的miRNA，其中一條鏈與Ago蛋白結合形成RNA介導的沉默復合體（RNA-induced silencing complex RISC），另一條降解。RISC可在胞漿內結合靶mRNA，抑制靶基因的翻譯或誘導降解。另外，miRNA可以輸出至細胞外，輸出的載體包括胞外體、微囊泡、RNA結合蛋白（miRNA-binding protein complexes，RBP）或高密度脂蛋白（high density lipoproteins，HDL）。輸出至胞外的miRNA可以作用于受體細胞調節(jié)受體細胞基因的表達。實現(xiàn)細胞之間信息的傳遞及調控。

4循環(huán)miRNA作為標志物

一直以來，人類理想的生物標志物應符合以下條件：①可以通過非侵入性操作獲得，②具有高度的敏感性及特異性，③在疾病的早期階段即能診斷。④隨著疾病的轉歸，呈現(xiàn)相應的指標改變。⑤在樣本中的半衰期長，⑥檢測方法簡便，便于快速檢測[30]。循環(huán)miRNA在血漿中存在的穩(wěn)定性及可以定量檢測的的特性引起了科研工作者的極大興趣。由于循環(huán)miRNA滿足了人類對循環(huán)標志物的全部幻想，應用前景十分廣闊，自2009年開始相繼有10多項研究先后報道了循環(huán)miRNA作為心血管系統(tǒng)的血漿標志物，用于診斷及預后評價。其中包括心肌梗死、心力衰竭、動脈粥樣硬化和高血壓等。盡管以上的結果還需要大規(guī)模多中心的研究進一步驗證，但以上的研究至少證實了部分血漿miRNA的心血管特異性。不但能用于心血管疾病的診斷及療效觀察，而且為臨床研究提出了新的治療終點。關于心血管疾病中的miRNA標志物的研究匯總見表1。

5急性心肌梗死與循環(huán)miRNA

曾經(jīng)設想存在一種心肌細胞特異性的miRNA，在心肌損傷時快速釋放入循環(huán)血液中，可以通過這種特異的miRNA準確的診斷心肌損傷。這一設想正在逐步實現(xiàn)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在急性心肌梗死時有4種miRNA特異性升高。分別是miR-208a， miR-499， miR-1， 和 miR-133[1，31-38]。 其中miRNA-208a編碼α-MHC基因內含子，是目前發(fā)現(xiàn)的最為特異性的心肌來源的miRNA[39]，在心肌以外的組織沒有發(fā)現(xiàn)。而其他3種miRNA(miR-499，miR-1，miR-133)除了存在于心肌細胞，在骨骼肌中也發(fā)現(xiàn)一定水平的表達[40，41]。

一項研究[1]納入了66例胸痛患者，均進行了心肌酶、心電圖檢查，并進行了冠脈造影，同時納入了30例健康對照。66例胸痛患者均完成了上述檢查確診心肌梗死患者為33例，另外33例為非心梗的胸痛患者。時時熒光定量 PCR顯示miR-1，miR-133a和miR-499血漿水平在心梗組顯著升高，對比非心梗胸痛組和健康對照組均有統(tǒng)計學差異。miR-208a目前發(fā)現(xiàn)的唯一的心臟特異性的miRNA，在非心肌組織中未發(fā)現(xiàn)表達，因此是診斷急性心肌梗死最為理想的生物標志物。另有幾項研究顯示miR-499在急性心肌梗死中的診斷價值[1，31，33，36]。與miR-208a相比，miR-499的優(yōu)勢在于檢測的穩(wěn)定性，miR-499的釋放晚于miR-208a和cTnI，因此在診斷晚期心梗更有價值。miR-1和miR-133a由于在骨骼肌高表達，血漿水平受到骨骼肌和其他組織病理變化的影響，作為心肌梗死血漿標志物仍有爭議[1，33，37，38]。綜合以上研究結果，聯(lián)合應用miR-208a和miR-499水平診斷急性心肌梗死是非?？尚械?，miR-208a可用于早期的診斷，而miR-499用于追蹤晚期的心梗。

6心力衰竭和循環(huán)miRNA

有幾項研究進行了心力衰竭中相關的的循環(huán)miRNA標志物的探索，其中一項研究納入了12例心衰患者和12例健康對照進行了基因芯片的研究[2]。排除近期的心肌缺血和心梗，為的是結果不受心肌細胞壞死的影響，確實在研究中未發(fā)現(xiàn)梗死相關的miR-1， miR-208a， miR-208b 或miR-499的升高。通過基因芯片初步鎖定了16個候選基因，為了進一步的確認繼續(xù)進行了下面的實驗，納入50例主訴為呼吸困難的患者，其中30例確診為心力衰竭，另外20例非心源性呼吸困難作為對照組。7種miRNA被證實與心衰相關包括miR-423-5p， miR-18b*， miR-129-5p， miR-1254， miR-675， HS_202.1， 和miR-622。其中 miR-423-5p與心力衰竭診斷的相關性最好，ROC曲線分析顯AUC為 0.91 (95%CI 0.84~ 0.98)。本研究的對照組不是選擇健康對照組是選擇非心源性呼吸困難的患者，篩選出來的miRNA在呼吸困難的鑒別診斷方面非常有意義。例如miR-675，與健康對照組相比在心衰患者中顯著升高，相關性良好，但在本研究中發(fā)現(xiàn)miR-675在非心源性呼吸困難的患者中也出現(xiàn)升高，因此以miR-675作為心衰的標志物并不是特異性的。研究顯示還有一部分miRNA與疾病的嚴重程度相關，如循環(huán)miR-423-5p 和 miR-18b*與射血分數(shù)和紐約心功能分級呈負相關?；谶@一特性，作為心衰的標志物循環(huán)miR-423-5p 和 miR-18b*是非常有吸引力的，但還有一些重要的問題尚未解決。首先，還不清楚哪種細胞釋放miR-423-5p。有報道指出在心衰患者的頓抑心肌miR-423-5p呈高表達，提示循環(huán)中的miR-423-5p來源于頓抑心肌細胞的釋放[2]。

Fukushima等[43]納入10例心衰患者和17例無癥狀的對照組，共分析了3種miRNA， 發(fā)現(xiàn)內皮細胞來源的miR-126與年齡(相關系數(shù)0.52，P=0.0006)、腦鈉肽(相關系數(shù)0.25，P=0.0003)、紐約心功能分級呈負相關，提示miRNA作為心衰標志物的可能性。在冠心病患者[3]和2型糖尿病患者[46]中也發(fā)現(xiàn)了miRNA-126的低表達。更多的關于心衰的循環(huán)miRNA還有待進一步的研究。

7冠狀動脈粥樣硬化相關與miRNA

動脈粥樣硬化是心血管疾病的主要病因，被認為是血管壁的慢性炎癥改變，目前的影像學檢查技術僅能辨認較晚期的不穩(wěn)定斑塊。因此臨床迫切需要有更可靠地血漿標志物能對早期的不穩(wěn)定斑塊做出診斷，并對預后提供指導。為此，科研工作者進行了大量的研究，以下將介紹幾個相關的研究。

Fichtlscherer[3]首先對穩(wěn)定性心絞痛患者相關的miRNA進行了研究。該研究納入了經(jīng)冠脈造影確診的冠心病患者，通過對8例冠心病和8例健康對照的基因芯片研究顯示其中46種miRNA下調，20種miRNA上調。在接下來的實驗中納入36例冠脈造影確診的冠心病患者和17例對照，通過Real-time PCR對所有差異表達的miRNA進行定量。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)表達下調的miRNA均來自血管壁，特別是內皮細胞。包括已知的內皮細胞來源的miR-126，miR-92a， 和miR-17。另外血管平滑肌來源的miR-145和 炎癥細胞相關的miR-155在冠心病患者中表達也出現(xiàn)下調。

對穩(wěn)定性冠心病患者的研究中發(fā)現(xiàn)內皮細胞相關的miRNA表達減低絕對是驚人的發(fā)現(xiàn)，因為動脈粥樣硬化病變時內皮細胞會激活，激活的內皮細胞會誘導細胞內含miRNA的顆粒的釋放，但研究的結果卻顯示內皮細胞相關的miRNA在穩(wěn)定性冠心病患者中表達減低[47]。分析原因之一是這種內皮細胞miRNA的減少間接反應了冠心病患者循環(huán)內皮祖細胞的減少[48]。另一個解釋是miR-126是與年齡呈負相關的miRNA[43]，而該研究兩組人群未進行年齡的匹配，冠心病組年齡大，且年齡差差在30歲左右，也是造成冠心病組miR-126低表達的原因。miRNA-126在高齡組表達減低的另一原因是冠心病患者灌注的衰退及缺少新的內皮細胞的補充，另外細胞老化也造成miRNA的釋放減少[43]。

miR-155在冠心病組表達下調也是沒有預料到的，已知miR-155是炎癥相關的miRNA，主要來源于炎癥細胞[3]，而動脈粥樣硬化這種管壁的炎癥改變卻未見到miR-155的升高，反而出現(xiàn)表達下調?？赡艿慕忉尠挲g及性別因素，miR-155表達水平與年齡呈負相關，而且在男性表達低于女性[3]。

Taurino 等[44]進行了一項全血的基因芯片研究，對其中納入的10例冠心病患者進行了冠狀動脈旁路移植手術，并進行了康復治療。miR-92在心臟康復治療后表達呈現(xiàn)上調。這一結論與Fichtlscherer[3]的研究相吻合，該研究曾報道在冠心病組miR-92血漿水平下調。

Hoekstra等[45]也進行了冠心病患者miRNA的研究，不同的是該研究應用的是外周血管單核細胞(PBMC)。顯示在2個冠心病組miR-135a增加5倍，miR-147增加4倍。其中miR-147曾被報道與免疫細胞向炎細胞轉型并發(fā)揮發(fā)揮抗炎作用有關，能促進腫瘤壞死因子α和白介素-6的釋放[49]。這項研究提示外周血單核細胞miRNA在動脈粥樣硬化時會傾向于轉換為炎癥表型。不穩(wěn)定心絞痛和穩(wěn)定性心絞痛患者的miRNA也發(fā)現(xiàn)存在差異表達，有3種循環(huán)miRNA (miR-134， miR-198和 miR-370)在不穩(wěn)定心絞痛患者中表達升高，這種升高是否揭示了斑塊存的不穩(wěn)定[50]。還有待進一步驗證。

總之，以上的研究結果提示循環(huán)miRNA作為生物標志物有望對冠心病的診斷及預測提供幫助，但所報道的研究均是人群的小樣本研究，研究的結論仍需要大規(guī)模的臨床研究進一步證實。

8循環(huán)miRNA與高血壓

在對高血壓患者miRNA譜的研究中同樣發(fā)現(xiàn)存在特異的高血壓相關的miRNA[4]。其中，最有意義的發(fā)現(xiàn)是編碼人類巨細胞病毒的miRNA hcmv-miR-UL112特異性的升高。提示原發(fā)性高血壓可能與巨細胞病毒感染有關。該研究[4]顯示高血壓患者HCMV病毒滴度高于對照組（1870 : 54）。而且在高血壓患者中發(fā)現(xiàn)HCMV病毒滴度與人巨細胞病毒-miR-UL112水平相關。（p=0.003）這一結論在動物實驗中得到了進一步的驗證[51]，研究發(fā)現(xiàn)鼠巨細胞病毒感染小鼠后會導致小鼠的高血壓。這一研究結果為原發(fā)性高血壓的病因提供了新的理論研究，也為治療提供了新的靶點。但由于hcmv-miR-UL112在人群中變異較大，尚不能用于高血壓診斷及預測的生物標志物。

9循環(huán)MiRNA作為生物標志物的前景展望

目前，心血管疾病循環(huán)生物標志物局限于特異的蛋白，如肌鈣蛋白，B型尿鈉肽等。發(fā)展新的蛋白標志物已經(jīng)遭遇瓶頸，原因是蛋白在血循環(huán)中多以復合物形式存在，成分復雜，不易分離，而且蛋白合成后要經(jīng)過轉錄后加工，這種加工造成了蛋白的多樣性，檢測易出現(xiàn)誤差。再者，在血漿中豐度低，也很難開發(fā)相應的檢測試劑盒，不能滿足臨床快速檢驗的需求[30]。而循環(huán)miRNA擁有優(yōu)秀的生物標志物的特性。如：穩(wěn)定性，因為RNA序列在進化上相對保守；具有組織細胞特性性，而且在病理狀態(tài)呈差異表達；可以通過real-time PCR定量檢測，有高度的敏感性和特異性。然而，循環(huán)miRNA作為生物標志物同樣存在挑戰(zhàn):首先，血液中總RNA含量低，不能直接從循環(huán)中檢測miRNA的含量。因此，不同實驗室不同的檢測方法造成的結果不同，缺乏橫向的可比性，因此檢測需要標準化。目前還在研究當中，相信隨著miRNA 更多的生物學功能的揭示，結合基因組學、蛋白質組學、代謝組學和系統(tǒng)生物學研究的結果，多種疾病產(chǎn)生和發(fā)展的機制將會被闡明，疾病檢測、預測的準確性及靈敏度將會大大提高，疾病治療的手段將會更加豐富和有效。

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編輯/哈濤