雙歧桿菌發(fā)酵工藝研究

摘要：雙歧桿菌是人和動物腸道內(nèi)最重要的生理性細(xì)菌之一，具有維持生態(tài)平衡、生物拮抗、免疫調(diào)節(jié)和營養(yǎng)等多方面的生理功能。本文介紹了雙歧桿菌的發(fā)酵工藝研究進(jìn)展，主要對發(fā)酵工藝的菌種選育、培養(yǎng)基優(yōu)化、培養(yǎng)方式三個(gè)方面進(jìn)行了闡述，并對雙歧桿菌的發(fā)展前景進(jìn)行了分析和展望。

關(guān)鍵詞：雙歧桿菌；發(fā)酵工藝；研究進(jìn)展雙歧桿菌（Bifidobacterium）最早是由法國巴斯德研究所的Henry Tissier(1899)從母乳喂養(yǎng)嬰兒糞便中分離獲得呈不規(guī)則形態(tài)的革蘭氏陽性桿菌。雙歧桿菌主要寄生在人和動物的腸道內(nèi)，對宿主發(fā)揮生物屏障、營養(yǎng)、免疫、延緩衰老、抗腫瘤等生理作用。雙歧桿菌是人體腸道內(nèi)的正常菌群之一，其存在和數(shù)量隨著年齡增長而變化，是人體健康的風(fēng)向標(biāo)[1]。早在20世紀(jì)中，人們就利用雙歧桿菌制成活菌制劑治療腹瀉等疾病，并且得到了長足的發(fā)展。其中提供菌體得率，獲得更多的活菌體，一直都是雙歧桿菌的研究重點(diǎn)。由于液體發(fā)酵具有發(fā)酵速度快、周期短和產(chǎn)量高的特點(diǎn)，目前大多數(shù)雙歧桿菌發(fā)酵都采用液體發(fā)酵工藝。其發(fā)酵流程一般采用如下路徑：菌種活化→種子液培養(yǎng)→發(fā)酵罐放大培養(yǎng)→菌體收集。

通過發(fā)酵工藝的優(yōu)化可大幅度提高菌體得率，降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。本文主要在菌種選育、培養(yǎng)基組分的優(yōu)化、發(fā)酵條件的優(yōu)化、發(fā)酵設(shè)備工藝的完善及培養(yǎng)方式創(chuàng)新等方面探討了雙歧桿菌發(fā)酵研究的相關(guān)進(jìn)展。

1菌種選育

性能優(yōu)良的菌株是進(jìn)行良好發(fā)酵的前提。根據(jù)不同的要求，選育出不同性能的菌株。由于雙歧桿菌屬于專性厭氧菌，且不耐酸。因此大大增加了培養(yǎng)難度，提高了生產(chǎn)成本。為減弱生產(chǎn)及儲存過程中氧氣的攝入對雙歧桿菌的毒害，日本已篩選出較耐氧的雙歧桿菌，但完全需氧的菌株尚未選育出。為了能夠活著到達(dá)人體腸內(nèi)，也篩選出耐酸及耐膽汁的雙歧桿菌。目前改善和提高雙歧桿菌耐氧性的方法主要是逐步馴化或基因誘變[2]。近年來，許多學(xué)者采用多種基因工程手段，構(gòu)建具有優(yōu)良性能的雙歧桿菌菌株。例如采用基因組重組方法，構(gòu)建具備不同特定優(yōu)良性狀的雙歧桿菌多態(tài)性文庫，通過多重遞歸原生質(zhì)體融合(RPF)使菌株之間進(jìn)行基因交換重組，最終獲得具有多種優(yōu)良性狀于一體的重組雙歧桿菌菌株。也有實(shí)驗(yàn)將專性厭氧短雙歧桿菌和典型上面發(fā)酵的啤酒酵母進(jìn)行原生質(zhì)體細(xì)胞融合獲得了具有耐氧性的融合子，明顯改善了雙歧桿菌的耐氧性。

2培養(yǎng)基優(yōu)化

雙歧桿菌對營養(yǎng)要求嚴(yán)格，不同種的菌株對營養(yǎng)要求也有所差異。性能優(yōu)良的培養(yǎng)基可顯著提高菌體得率，延緩遲滯期。目前對雙歧桿菌培養(yǎng)基成分的優(yōu)化主要是對碳源、氮源、礦物元素、雙歧因子等的篩選。

2.1碳源 雙歧桿菌以有機(jī)碳源作為能源和碳源。葡萄糖等單糖和一些低聚糖類可作為菌體的主要的碳源，但雙歧桿菌不能直接利用淀粉、纖維素等多聚糖類。雙歧桿菌體內(nèi)含有的許多人和動物體內(nèi)所不具有的糖代謝酶。許多促進(jìn)雙歧桿菌生長的碳源大多是能被雙歧桿菌利用但不能被人和動物機(jī)體利用的糖類，除乳酮糖外，主要為寡糖，乳寡果糖、寡半乳糖、大豆寡糖[3]。由于葡萄糖、果糖等單糖可被菌體快速利用，目前絕大多數(shù)雙歧桿菌培養(yǎng)基都使用由單糖和其他聚糖組成的復(fù)合碳源，而很少只含有單一碳源。

2.2氮源 雙歧桿菌的蛋白酶活性通常較弱，甚至缺乏必要的蛋白酶，最適氮源為蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物:蛋白胨、肽類和氨基酸等。Azao對低濃度下，碳源和氮源是否是生長限制性因子進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，葡萄糖不是生長限制性因子；而氮源，特別是酵母抽提物是生長限制性因子。1993年Klaver F A等報(bào)道將17個(gè)雙歧桿菌菌株在純牛奶中進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果又有15個(gè)菌株不能生長。但在添加酪蛋白降解產(chǎn)生的肽和氨基酸后即可獲得生長，這是因?yàn)檫@些菌株缺乏分解蛋白的酶。實(shí)驗(yàn)表明:人為添加動物性復(fù)合氨基酸，能夠使雙歧桿菌活菌數(shù)目獲得明顯提高，且活菌數(shù)目的衰減也會衰減[4]，如果培養(yǎng)基中缺乏天冬氨酸，雙歧桿菌的活性降低50%[5]；酵母膏中富含核苷酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，對活菌數(shù)目有明顯影響，在培養(yǎng)基中不加或少量添加酵母膏，菌體停止生長或很快死亡。研究發(fā)現(xiàn)，這此物質(zhì)均為含有硫的多肽類物質(zhì)，如果它們的二硫鍵被還原或烷基化則失去促雙歧桿菌生長的活性。

2.3礦物元素 雙歧桿菌要求礦物元素如鈉、鉀、磷、硫、銅、鐵、鎂、鈣、錳和鋅等。銅、銅、鋅是雙歧桿菌超氧化物歧化酶的主要組成部分，其含量對菌體生長有顯著地影響。NovikG.I等在青春雙歧桿菌94-BIM的培養(yǎng)基中添加一天然隧石粉時(shí)獲得的礦物質(zhì)，可顯著提高菌體生長速率，降低代時(shí)，增加如乙酸、乙醇和乳酸等代謝物的積累和胞外蛋白酶的表達(dá)水平。此外，雙歧桿菌能夠合成維生素B1，B2，B6和K等，而它們生長需要的維生素B2，B5，B6，B12等維生素B是組成各種酶的活性基本成分，如果缺失，其酶類沒有活性，菌體不能生長。

2.4雙歧因子 自然界中存在一些能夠促進(jìn)雙歧桿菌增殖的物質(zhì)，我們把這些物質(zhì)稱之為雙歧因子[6]。由于雙歧因子可明顯促進(jìn)雙歧桿菌的增殖，大量學(xué)者對雙歧因子進(jìn)行了大量研究。根據(jù)近年國內(nèi)外雙歧因子研究情況，從目前已報(bào)道的雙歧因子文獻(xiàn)分析，它主要包括低聚糖、蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物、天然植物和中草藥提取物類等。廣泛篩選合適的雙歧因子，促進(jìn)雙歧桿菌的增殖，獲得更多的活菌體，無論是對雙歧桿菌機(jī)理研究還是創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)價(jià)值，都具有重要意義。

3培養(yǎng)方式與菌體收集

發(fā)酵罐配有溫度和pH值控制系統(tǒng)，并可同時(shí)進(jìn)行補(bǔ)料，實(shí)現(xiàn)微生物的自動化培養(yǎng)，已經(jīng)成為規(guī)?；l(fā)酵雙歧桿菌的首選反應(yīng)容器。為了實(shí)現(xiàn)雙歧桿菌的高密度培養(yǎng)，同時(shí)考慮到雙歧桿菌嚴(yán)格的培養(yǎng)條件和營養(yǎng)要求，許多研究者對雙歧桿菌在發(fā)酵罐上的高密度培養(yǎng)進(jìn)行了大量的研究，采用的方法有分批補(bǔ)料培養(yǎng)、過濾培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)等[7]。曹郁生等報(bào)道了利用自己組裝的連續(xù)培養(yǎng)裝置，對兩歧雙歧桿菌的厭氧連續(xù)培養(yǎng)方法進(jìn)行了研究。控制連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)pH值為6.0，采用了種不同的稀釋率，以檢查稀釋率對培養(yǎng)物的影響，當(dāng)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)，分別對其活菌數(shù)量、乳酸和乙酸的產(chǎn)量進(jìn)行了分析。與靜置批量培養(yǎng)相比，連續(xù)培養(yǎng)方法得到的菌液中活菌數(shù)較高，活力好，單位容積的產(chǎn)量較高。Kwon[8]利用深層生物膜反應(yīng)器(submerged membrane bioreactor)實(shí)現(xiàn)了對B.bifidum的高密度培養(yǎng)，發(fā)酵36 h后，菌體密度可達(dá)到2.2×1010CFU/mL，較普通連續(xù)發(fā)酵提高了7.3倍。收集活菌體的方式大致有兩種：膜過濾法和離心法[9]。目前雙歧桿菌的手機(jī)多采用離心法。此法漸變、快捷、適于商業(yè)化生產(chǎn)。

4展望

由于雙歧桿菌屬于專性厭氧菌，且對營養(yǎng)要求嚴(yán)格，因此給雙歧桿菌的發(fā)酵帶來了很大困難。隨著微生態(tài)理論的發(fā)展和生物工程技術(shù)的進(jìn)步。通過進(jìn)一步選育更高耐氧耐酸的菌種，優(yōu)化培養(yǎng)基成分，改進(jìn)培養(yǎng)方式等手段來進(jìn)一步優(yōu)化雙歧桿菌發(fā)酵工藝。相信隨著雙歧桿菌發(fā)酵工藝的進(jìn)一步提高，雙歧桿菌必將在食品、醫(yī)藥以及飼料等方面發(fā)揮更重要的作用。

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編輯/張燕