雙歧桿菌發(fā)酵工藝研究

摘要：雙歧桿菌是人和動物腸道內(nèi)最重要的生理性細菌之一，具有維持生態(tài)平衡、生物拮抗、免疫調(diào)節(jié)和營養(yǎng)等多方面的生理功能。本文介紹了雙歧桿菌的發(fā)酵工藝研究進展，主要對發(fā)酵工藝的菌種選育、培養(yǎng)基優(yōu)化、培養(yǎng)方式三個方面進行了闡述，并對雙歧桿菌的發(fā)展前景進行了分析和展望。

關鍵詞：雙歧桿菌；發(fā)酵工藝；研究進展雙歧桿菌（Bifidobacterium）最早是由法國巴斯德研究所的Henry Tissier(1899)從母乳喂養(yǎng)嬰兒糞便中分離獲得呈不規(guī)則形態(tài)的革蘭氏陽性桿菌。雙歧桿菌主要寄生在人和動物的腸道內(nèi)，對宿主發(fā)揮生物屏障、營養(yǎng)、免疫、延緩衰老、抗腫瘤等生理作用。雙歧桿菌是人體腸道內(nèi)的正常菌群之一，其存在和數(shù)量隨著年齡增長而變化，是人體健康的風向標[1]。早在20世紀中，人們就利用雙歧桿菌制成活菌制劑治療腹瀉等疾病，并且得到了長足的發(fā)展。其中提供菌體得率，獲得更多的活菌體，一直都是雙歧桿菌的研究重點。由于液體發(fā)酵具有發(fā)酵速度快、周期短和產(chǎn)量高的特點，目前大多數(shù)雙歧桿菌發(fā)酵都采用液體發(fā)酵工藝。其發(fā)酵流程一般采用如下路徑：菌種活化→種子液培養(yǎng)→發(fā)酵罐放大培養(yǎng)→菌體收集。

通過發(fā)酵工藝的優(yōu)化可大幅度提高菌體得率，降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟效益。本文主要在菌種選育、培養(yǎng)基組分的優(yōu)化、發(fā)酵條件的優(yōu)化、發(fā)酵設備工藝的完善及培養(yǎng)方式創(chuàng)新等方面探討了雙歧桿菌發(fā)酵研究的相關進展。

1菌種選育

性能優(yōu)良的菌株是進行良好發(fā)酵的前提。根據(jù)不同的要求，選育出不同性能的菌株。由于雙歧桿菌屬于專性厭氧菌，且不耐酸。因此大大增加了培養(yǎng)難度，提高了生產(chǎn)成本。為減弱生產(chǎn)及儲存過程中氧氣的攝入對雙歧桿菌的毒害，日本已篩選出較耐氧的雙歧桿菌，但完全需氧的菌株尚未選育出。為了能夠活著到達人體腸內(nèi)，也篩選出耐酸及耐膽汁的雙歧桿菌。目前改善和提高雙歧桿菌耐氧性的方法主要是逐步馴化或基因誘變[2]。近年來，許多學者采用多種基因工程手段，構(gòu)建具有優(yōu)良性能的雙歧桿菌菌株。例如采用基因組重組方法，構(gòu)建具備不同特定優(yōu)良性狀的雙歧桿菌多態(tài)性文庫，通過多重遞歸原生質(zhì)體融合(RPF)使菌株之間進行基因交換重組，最終獲得具有多種優(yōu)良性狀于一體的重組雙歧桿菌菌株。也有實驗將專性厭氧短雙歧桿菌和典型上面發(fā)酵的啤酒酵母進行原生質(zhì)體細胞融合獲得了具有耐氧性的融合子，明顯改善了雙歧桿菌的耐氧性。

2培養(yǎng)基優(yōu)化

雙歧桿菌對營養(yǎng)要求嚴格，不同種的菌株對營養(yǎng)要求也有所差異。性能優(yōu)良的培養(yǎng)基可顯著提高菌體得率，延緩遲滯期。目前對雙歧桿菌培養(yǎng)基成分的優(yōu)化主要是對碳源、氮源、礦物元素、雙歧因子等的篩選。

2.1碳源 雙歧桿菌以有機碳源作為能源和碳源。葡萄糖等單糖和一些低聚糖類可作為菌體的主要的碳源，但雙歧桿菌不能直接利用淀粉、纖維素等多聚糖類。雙歧桿菌體內(nèi)含有的許多人和動物體內(nèi)所不具有的糖代謝酶。許多促進雙歧桿菌生長的碳源大多是能被雙歧桿菌利用但不能被人和動物機體利用的糖類，除乳酮糖外，主要為寡糖，乳寡果糖、寡半乳糖、大豆寡糖[3]。由于葡萄糖、果糖等單糖可被菌體快速利用，目前絕大多數(shù)雙歧桿菌培養(yǎng)基都使用由單糖和其他聚糖組成的復合碳源，而很少只含有單一碳源。

2.2氮源 雙歧桿菌的蛋白酶活性通常較弱，甚至缺乏必要的蛋白酶，最適氮源為蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物:蛋白胨、肽類和氨基酸等。Azao對低濃度下，碳源和氮源是否是生長限制性因子進行了研究，結(jié)果表明，葡萄糖不是生長限制性因子；而氮源，特別是酵母抽提物是生長限制性因子。1993年Klaver F A等報道將17個雙歧桿菌菌株在純牛奶中進行培養(yǎng)，結(jié)果又有15個菌株不能生長。但在添加酪蛋白降解產(chǎn)生的肽和氨基酸后即可獲得生長，這是因為這些菌株缺乏分解蛋白的酶。實驗表明:人為添加動物性復合氨基酸，能夠使雙歧桿菌活菌數(shù)目獲得明顯提高，且活菌數(shù)目的衰減也會衰減[4]，如果培養(yǎng)基中缺乏天冬氨酸，雙歧桿菌的活性降低50%[5]；酵母膏中富含核苷酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，對活菌數(shù)目有明顯影響，在培養(yǎng)基中不加或少量添加酵母膏，菌體停止生長或很快死亡。研究發(fā)現(xiàn)，這此物質(zhì)均為含有硫的多肽類物質(zhì)，如果它們的二硫鍵被還原或烷基化則失去促雙歧桿菌生長的活性。

2.3礦物元素 雙歧桿菌要求礦物元素如鈉、鉀、磷、硫、銅、鐵、鎂、鈣、錳和鋅等。銅、銅、鋅是雙歧桿菌超氧化物歧化酶的主要組成部分，其含量對菌體生長有顯著地影響。NovikG.I等在青春雙歧桿菌94-BIM的培養(yǎng)基中添加一天然隧石粉時獲得的礦物質(zhì)，可顯著提高菌體生長速率，降低代時，增加如乙酸、乙醇和乳酸等代謝物的積累和胞外蛋白酶的表達水平。此外，雙歧桿菌能夠合成維生素B1，B2，B6和K等，而它們生長需要的維生素B2，B5，B6，B12等維生素B是組成各種酶的活性基本成分，如果缺失，其酶類沒有活性，菌體不能生長。

2.4雙歧因子 自然界中存在一些能夠促進雙歧桿菌增殖的物質(zhì)，我們把這些物質(zhì)稱之為雙歧因子[6]。由于雙歧因子可明顯促進雙歧桿菌的增殖，大量學者對雙歧因子進行了大量研究。根據(jù)近年國內(nèi)外雙歧因子研究情況，從目前已報道的雙歧因子文獻分析，它主要包括低聚糖、蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物、天然植物和中草藥提取物類等。廣泛篩選合適的雙歧因子，促進雙歧桿菌的增殖，獲得更多的活菌體，無論是對雙歧桿菌機理研究還是創(chuàng)造經(jīng)濟價值，都具有重要意義。

3培養(yǎng)方式與菌體收集

發(fā)酵罐配有溫度和pH值控制系統(tǒng)，并可同時進行補料，實現(xiàn)微生物的自動化培養(yǎng)，已經(jīng)成為規(guī)模化發(fā)酵雙歧桿菌的首選反應容器。為了實現(xiàn)雙歧桿菌的高密度培養(yǎng)，同時考慮到雙歧桿菌嚴格的培養(yǎng)條件和營養(yǎng)要求，許多研究者對雙歧桿菌在發(fā)酵罐上的高密度培養(yǎng)進行了大量的研究，采用的方法有分批補料培養(yǎng)、過濾培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)等[7]。曹郁生等報道了利用自己組裝的連續(xù)培養(yǎng)裝置，對兩歧雙歧桿菌的厭氧連續(xù)培養(yǎng)方法進行了研究?？刂七B續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)pH值為6.0，采用了種不同的稀釋率，以檢查稀釋率對培養(yǎng)物的影響，當達到穩(wěn)定狀態(tài)時，分別對其活菌數(shù)量、乳酸和乙酸的產(chǎn)量進行了分析。與靜置批量培養(yǎng)相比，連續(xù)培養(yǎng)方法得到的菌液中活菌數(shù)較高，活力好，單位容積的產(chǎn)量較高。Kwon[8]利用深層生物膜反應器(submerged membrane bioreactor)實現(xiàn)了對B.bifidum的高密度培養(yǎng)，發(fā)酵36 h后，菌體密度可達到2.2×1010CFU/mL，較普通連續(xù)發(fā)酵提高了7.3倍。收集活菌體的方式大致有兩種：膜過濾法和離心法[9]。目前雙歧桿菌的手機多采用離心法。此法漸變、快捷、適于商業(yè)化生產(chǎn)。

4展望

由于雙歧桿菌屬于專性厭氧菌，且對營養(yǎng)要求嚴格，因此給雙歧桿菌的發(fā)酵帶來了很大困難。隨著微生態(tài)理論的發(fā)展和生物工程技術(shù)的進步。通過進一步選育更高耐氧耐酸的菌種，優(yōu)化培養(yǎng)基成分，改進培養(yǎng)方式等手段來進一步優(yōu)化雙歧桿菌發(fā)酵工藝。相信隨著雙歧桿菌發(fā)酵工藝的進一步提高，雙歧桿菌必將在食品、醫(yī)藥以及飼料等方面發(fā)揮更重要的作用。

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編輯/張燕