流式細(xì)胞儀檢測(cè)HLA-B27及其臨床意義

摘要：目的通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)人體外周血HLA-B27的檢測(cè)，來(lái)評(píng)價(jià)HLA-B27輔助臨床診斷強(qiáng)直性脊柱炎（AS）的應(yīng)用價(jià)值。方法56例強(qiáng)直性脊柱炎患者和51例健康體檢者，用熒光標(biāo)記的抗HLA-B27/CD3單克隆抗體與其外周血（以EDTA-K2抗凝）特異性結(jié)合，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其熒光強(qiáng)度來(lái)反映細(xì)胞表面HLA-B27抗原的表達(dá)。結(jié)果從流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，56例AS患者中，HLA-B27陽(yáng)性51例，陽(yáng)性率為91.1%；51例健康體檢者中，HLA-B27陽(yáng)性3例，陽(yáng)性率為5.9%。兩者存在顯著性差異，P<0.01。結(jié)論AS患者HLA-B27陽(yáng)性率明顯高于正常人，所以檢測(cè)HLA-B27對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎的診斷與鑒別診斷有著重要的意義。

關(guān)鍵詞：流式細(xì)胞儀；強(qiáng)直性脊柱炎；HLA-B27B27是HLA-B27位點(diǎn)上的一個(gè)重要的等位基因，其與許多疾病具有相關(guān)性，尤其是強(qiáng)直性脊柱炎；而且這種相關(guān)是迄今為止已知的HLA與疾病的關(guān)聯(lián)中最強(qiáng)和最典型的。目前，檢測(cè)HLA-B27的主要方法有補(bǔ)體依賴性微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)、玫瑰花法、ELISA法、流式細(xì)胞術(shù)、PCR法等。其中以標(biāo)準(zhǔn)的NIH微量細(xì)胞毒法最為常用，這種方法操作簡(jiǎn)便且準(zhǔn)確性尚可，但是受細(xì)胞純度、補(bǔ)體差異、單抗效價(jià)及HLA高度多態(tài)性的影響，易出現(xiàn)漏診或假陽(yáng)性(錯(cuò)判、誤判)[1]?，F(xiàn)在我們用熒光標(biāo)記的單克隆抗體與人類白細(xì)胞表面抗原HLA-B27結(jié)合，用流式細(xì)胞儀來(lái)檢測(cè)其細(xì)胞表面的HLA-B27表達(dá)，現(xiàn)報(bào)告如下：

1資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1標(biāo)本來(lái)源107例該院骨科門診及住院確診為AS的患者和健康體檢者。其中經(jīng)臨床檢查和影像學(xué)檢查符合AS的患者56例，男38例，女18例，年齡18~77歲。健康體檢者51例，男27例，女24例，年齡23~82歲。取上述人員靜脈血2ml，EDTA-K2抗凝。

1.1.2 試劑美國(guó)Becton Dickinson公司HLA-B27 kit: HLA-B27-FITC (Clone GS145.2，IgG1 kappa)；CD3-PE(CloneSK7，IgG1 kappa)；HLA-B27 Calibration Bead；溶血?jiǎng)?Lysing solution．1ys S) 批號(hào)為340183，洗滌液及鞘液用Coulter Isoton II血細(xì)胞稀釋液 批號(hào)為 8546733。

1.1.3 儀器美國(guó)Beckman CoulterEPICSXL-MCL型流式細(xì)胞儀

1.2方法

1.2.1 標(biāo)本處理取HLA-B27-FITC/CD3-PE熒光抗體30ul、全血樣本50ul加入流式專用試管底部，混勻，置于室溫避光15min。加10倍稀釋后的溶血?jiǎng)?ml，混勻，避光15min。1500r/min離心5min。棄上清液后用0.01N PBS洗滌兩次，上機(jī)測(cè)定。

1.2.2檢測(cè)與結(jié)果判斷①流式細(xì)胞儀校正使用Beckman Coulter公司的FLOW-CHECK校準(zhǔn)光路 ②樣本檢測(cè) 取標(biāo)準(zhǔn)熒光微球1滴Calibration Bead，用1ml蒸餾水稀釋，測(cè)到一標(biāo)準(zhǔn)峰。分析已經(jīng)處理好的樣本，選取以CD3-PE標(biāo)記的淋巴細(xì)胞，并檢測(cè)這群細(xì)胞HLA-B27的中間熒光強(qiáng)度(Mdx)，若中間熒光強(qiáng)度大于標(biāo)準(zhǔn)微球峰熒光強(qiáng)度即為陽(yáng)性，反之則為陰性

2結(jié)果

HLA-B27在強(qiáng)直性脊炎患者（AS）和健康體檢者中檢測(cè)結(jié)果如下：臨床診斷：AS患者例數(shù)：56例。陽(yáng)性例數(shù)：51例。陽(yáng)性率為91.1%，健康體檢者 例數(shù)：51例。陽(yáng)性例數(shù)：3例。陽(yáng)性率為5.9%

從上述結(jié)果可以看出，AS患者HLA-B27的陽(yáng)性率高于健康體檢者的陽(yáng)性率。

3討論

強(qiáng)直性脊椎炎(ankylosing spondylitis，AS)是一種慢性、進(jìn)行性和炎性疾病，主要累及骶骼關(guān)節(jié)、脊柱、脊柱軟組織及四肢關(guān)節(jié)，主要癥狀是腰、骶及下肢關(guān)節(jié)疼痛，晚期患者脊柱僵硬呈板狀，活動(dòng)受限。HLA-B27與 AS 發(fā)病呈高度相關(guān)，其相關(guān)性為目前已知的HLA與疾病關(guān)系中關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)和最典型的一種[2]。有研究表明，HLA-B27檢測(cè)可提高 X 線診斷AS 的陽(yáng)性率，對(duì)AS早期尤其是X線表現(xiàn)不典型時(shí)具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值[3]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示AS患者HLA-B27陽(yáng)性率顯著高于正常人陽(yáng)性率，但HLA-B27陽(yáng)性不能診斷隨機(jī)選擇患者是否患有AS，因?yàn)榉茿S患者也有3%～7%的陽(yáng)性率，但當(dāng)臨床癥狀體征及影像學(xué)檢查懷疑有AS時(shí)HLA-B27陽(yáng)性可作為診斷指標(biāo)。如某患者診斷AS的可能性為50％，若患者陽(yáng)性，則診斷AS的概率提高到95％左右；若該患者HLA-B27陰性，則患AS的概率降至3％左右。AS患者的臨床癥狀與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有相似之處，因此對(duì)確診為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者要進(jìn)行B27的檢測(cè)，以免漏診。少兒患者因骶髂關(guān)節(jié)骨后未閉合，也給炎癥程度的判斷造成困難。所以，AS從發(fā)病到明確診斷往往需幾年時(shí)間。而B27檢測(cè)可以彌補(bǔ)上述不足，因此B27檢測(cè)可作為AS的篩選方法。

過(guò)去使用的血清學(xué)方法存在許多不足：要求用血量大，需無(wú)菌分離淋巴細(xì)胞，而且分離的淋巴細(xì)胞要有足夠的活性。所用抗血清為多克隆抗體，特異性較差，實(shí)驗(yàn)不易標(biāo)準(zhǔn)化，分析所需時(shí)間較長(zhǎng)，判斷通過(guò)記數(shù)死亡的淋巴細(xì)胞的方法，常含主觀人為因素影響。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)，根據(jù)直接熒光染色的原理，通過(guò)雙色直接免疫熒光單克隆抗體試劑抗HLA-B27-FITC／CD3-PE與成人外周血淋巴細(xì)胞特異性結(jié)合，使細(xì)胞具有一定的熒光強(qiáng)度，這種熒光強(qiáng)度可被流式細(xì)胞儀測(cè)得，從而判斷HLA-B27抗原陽(yáng)性或陰性，同時(shí)可以根據(jù)熒光強(qiáng)弱的大小來(lái)進(jìn)行判斷HLA-B27的表達(dá)情況，具有快速、簡(jiǎn)單、特異性高的優(yōu)點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

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編輯/孫杰