基于血清代謝物的血管內(nèi)皮功能障礙預(yù)測(cè)模型研究

血管內(nèi)皮功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化性心血管病可檢測(cè)到的最早期病理改變，被認(rèn)為是心血管事件的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[1-2]。如今心血管病已是造成我國(guó)居民死亡和疾病負(fù)擔(dān)的首要原因[3-4]，開(kāi)展人群血管內(nèi)皮功能障礙的篩查對(duì)于識(shí)別心血管病早期危險(xiǎn)個(gè)體及其早期預(yù)防具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前血管內(nèi)皮功能可靠的無(wú)創(chuàng)性評(píng)價(jià)方法是通過(guò)超聲測(cè)量肱動(dòng)脈血流介導(dǎo)的血管舒張功能（FMD）[5]，但FMD 檢測(cè)需要專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行操作，對(duì)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)環(huán)境和受檢者要求較高[6]，并且在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)等，導(dǎo)致其在一些人群現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查中的實(shí)施可行性較低。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮功能障礙與內(nèi)皮細(xì)胞代謝密切相關(guān)[7-8]，代謝產(chǎn)物如血清尿酸的改變可提示機(jī)體血管內(nèi)皮功能障礙的發(fā)生[9]。為此，本研究基于氣相色譜—飛行時(shí)間質(zhì)譜（gas chromatography time-of-flight mass spectrometry,GC-TOF-MS）技術(shù)的非靶標(biāo)代謝組，檢測(cè)血管內(nèi)皮功能障礙者和正常者的血清代謝物。利用血清差異代謝物構(gòu)建血管內(nèi)皮功能障礙預(yù)測(cè)模型并進(jìn)行驗(yàn)證，為識(shí)別人群中血管內(nèi)皮功能障礙的個(gè)體提供一種參考方法。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

于2015 年在廣西壯族自治區(qū)兩鄉(xiāng)鎮(zhèn)現(xiàn)場(chǎng)招募常住居民795 名。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）禁食至少8 h；（2）年齡18～80 歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有冠心病、外周動(dòng)脈疾病、腦卒中（22 例）；（2）近3 天服用血管舒張藥、降血脂藥或其他藥物（253 例）；（3）FMD 缺失（7 例）。排除282 人后，兩鄉(xiāng)鎮(zhèn)共納入513 名居民，將其中一個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)383 名居民按血管內(nèi)皮功能不同狀態(tài)（FMD＜6%為血管內(nèi)皮功能障礙，F(xiàn)MD≥6%為血管內(nèi)皮功能正常[10]）分為兩類(lèi)，按照年齡和性別進(jìn)行整體匹配，最后共納入77 名居民作為建模組，用以模型構(gòu)建；從另一鄉(xiāng)鎮(zhèn)130 名居民中抽取26 名作為外驗(yàn)證組，用以模型外部驗(yàn)證。共納入103 例研究對(duì)象。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審批（批準(zhǔn)文號(hào)：20130306-2），所有研究對(duì)象均已被告知研究目的與內(nèi)容并同意參加研究。

1.2 調(diào)查方法

經(jīng)由統(tǒng)一培訓(xùn)的調(diào)查人員對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查、體格檢查和血樣采集。問(wèn)卷調(diào)查收集研究對(duì)象性別、年齡、吸煙、飲酒情況等基本信息，體格檢查獲取身高、體重、血壓，F(xiàn)MD 等資料。現(xiàn)場(chǎng)采集研究對(duì)象外周靜脈血4～5 ml，分離血清后，置于-80℃冰箱保存。

1.3 肱動(dòng)脈FMD 檢測(cè)

以超聲測(cè)量的肱動(dòng)脈FMD 為金標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)研究對(duì)象血管內(nèi)皮功能。FMD 檢測(cè)遵循《內(nèi)皮依賴(lài)性血流介導(dǎo)的肱動(dòng)脈血管舒張的超聲評(píng)估指南》[6]，采用血管內(nèi)皮功能檢測(cè)儀（UNEXEF38G，日本）在室溫、安靜、光線較暗的環(huán)境下進(jìn)行檢測(cè)。受檢者靜坐休息至少15 min 后進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，受檢者處于平臥位，暴露右上臂。將血壓計(jì)袖帶縛于右上臂，H 型探頭置于右側(cè)手臂肘上約5～10 cm 的肱動(dòng)脈部位，測(cè)量安靜狀態(tài)下肱動(dòng)脈基礎(chǔ)直徑，記為D0。保持探頭位置不變，將血壓計(jì)袖帶加壓至高于收縮壓50 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）以阻斷血流，5 min后放開(kāi)袖帶，測(cè)量袖帶放開(kāi)后30～120 s 內(nèi)反應(yīng)性充血最大擴(kuò)張直徑，記為D1。FMD=[（D1-D0）/D0]×100%。

1.4 血清代謝物測(cè)定

代謝物測(cè)定參考文獻(xiàn)[11]的方法，取100 μl 血清于1.5 ml 離心管中，加入350 μl 甲醇和20 μl L-2-氯苯丙氨酸（內(nèi)標(biāo)），混勻，在4℃下以13 000 轉(zhuǎn)/min 的轉(zhuǎn)速離心15 min。取400 μl 上清于2 ml 經(jīng)甲烷硅基化的進(jìn)樣瓶中。每個(gè)樣本各取4 μl 于新進(jìn)樣瓶中，混勻，作為質(zhì)控樣本。真空干燥樣本后，加入50 μl甲氧胺鹽（溶于吡啶，20 mg/ml），輕輕混勻后，置于80℃烘箱中孵育30 min。隨后向樣本中加入70 μl N,O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（含體積比為1%的三甲基氯硅烷），混勻后在70℃烘箱中孵育2 h，將樣本冷卻至室溫。向質(zhì)控樣本中加入10 μl 飽和脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)混合液（溶于氯仿C8-C16:1 mg/ml；C18-C24:0.5 mg/ml），混勻。

樣本采用Agilent 7890 GC-TOF-MS（Agilent公司，美國(guó)）進(jìn)行檢測(cè)，采用不分流模式，進(jìn)樣量1 μl，載氣為氦氣。前進(jìn)樣口吹掃流速3 ml/min，柱流速1 ml/min。柱溫：50℃保持1 min，以20℃每分鐘的速率上升至310℃，保持6 min。前進(jìn)樣口和傳輸線溫度分別為280℃和270℃。離子源溫度220℃，電離電壓-70 eV，掃描方式50～500 m/z，掃描速率20 pectra/s，溶劑延遲366 s。

應(yīng)用Chroma TOF 4.3X 軟件和LECO-Fiehn Rtx5數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)色譜峰進(jìn)行提取、數(shù)據(jù)基線過(guò)濾和校正、峰對(duì)齊、反卷積分析、峰定性和半定量。采用保留時(shí)間指數(shù)方法進(jìn)行峰定性，保留時(shí)間定性偏差為5 000，采用內(nèi)標(biāo)歸一化法進(jìn)行峰定量。通過(guò)LECO/Fiehn 代謝組學(xué)庫(kù)對(duì)代謝物進(jìn)行鑒定，相似度越高表明代謝物鑒定越準(zhǔn)確。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用Stata 13.1 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述和統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比（%）表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 確切概率法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

采用SIMCA 14.1 軟件對(duì)建模組代謝數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis,PCA）和正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal projections to latent structures discriminant analysis,OPLS-DA），并用200 次置換檢驗(yàn)判斷OPLS-DA 模型是否過(guò)度擬合，由此篩選出血管內(nèi)皮功能障礙者和正常者的差異代謝物。篩選標(biāo)準(zhǔn)為OPLS-DA 模型第一主成分的變量投影重要度（variable importance in the projection,VIP）值大于1 且兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)的P值＜0.05。以血管內(nèi)皮功能是否障礙為因變量（FMD≥6%=0，F(xiàn)MD＜6%=1），以不同的代謝物（經(jīng)自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換的相對(duì)定量值即代謝物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比）組合分別與性別（女=0，男=1）、年齡（連續(xù)型變量）作為自變量構(gòu)建多個(gè)Logistic 回歸模型。采用AUC 和Hosmer-Lemeshow 擬合優(yōu)度檢驗(yàn)，評(píng)價(jià)所有Logistic 回歸模型的預(yù)測(cè)能力和校準(zhǔn)能力，以ROC 曲線中最靠近左上角的點(diǎn)為模型最佳截?cái)帱c(diǎn)。

利用建模組數(shù)據(jù)采用十折交叉驗(yàn)證法對(duì)模型進(jìn)行內(nèi)部驗(yàn)證，外部驗(yàn)證是采用預(yù)測(cè)模型對(duì)外驗(yàn)證組的研究對(duì)象進(jìn)行預(yù)測(cè)，分別計(jì)算AUC、敏感度和特異度以評(píng)價(jià)模型預(yù)測(cè)能力。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者基本特征（表1）

本研究共納入103 例研究對(duì)象，其中建模組77例，平均年齡（57.0±6.5）歲，男性37 例（48.1%）；外驗(yàn)證組26 例，平均年齡（57.0±7.0）歲，男性14例（53.8%）。

表1 兩組受試者基本特征［例（%）］

對(duì)建模組和外驗(yàn)證組受試者的血管內(nèi)皮功能障礙者和血管內(nèi)皮功能正常者進(jìn)行均衡性檢驗(yàn)。表1顯示，兩組中血管內(nèi)皮功能障礙者和血管內(nèi)皮功能正常者在性別、年齡、民族、教育程度、吸煙情況、飲酒情況、高血壓、糖尿病和體重指數(shù)（BMI）方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

2.2 PCA 與OPLS-DA 分析結(jié)果

建模組代謝數(shù)據(jù)的PCA 分析結(jié)果顯示，血管內(nèi)皮功能障礙者和正常者的得分點(diǎn)存在小部分重疊，區(qū)分較顯著。為了獲得更好的組間分離，進(jìn)一步進(jìn)行OPLS-DA 分析。由圖1 可看出，所有樣本均處于95%CI 內(nèi)，兩組樣本得分點(diǎn)完全區(qū)分，表明這兩類(lèi)人群的代謝特征有區(qū)別。OPLSDA 模型解釋率（R2Y）和預(yù)測(cè)率（Q2）分別為0.949和0.720，置換檢驗(yàn)R2和Q2截距分別為0.825和-0.437，表明OPLS-DA 模型可以很好地解釋血管內(nèi)皮功能障礙者和正常者之間的差異性，且不存在過(guò)度擬合現(xiàn)象。

圖1 建模組正交偏最小二乘法-判別分析得分圖（n=77）

2.3 建模組中血管內(nèi)皮功能障礙者和正常者的血清差異代謝物（表2）

根據(jù)建模組OPLS-DA 分析得出的VIP 值，結(jié)合兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，篩選出血管內(nèi)皮功能障礙者和正常者的血清差異代謝物共16 個(gè)。與血管內(nèi)皮功能正常者相比，血管內(nèi)皮功能障礙者的尿酸、色氨酸、松香酸、蔗糖、果糖、花生酸、β-胸苷、谷氨酸、棕櫚油酸、2-甲基戊酸、百里香酚水平相對(duì)降低（變化倍數(shù)＜1），而尿素、阿拉伯糖醇、尿苷、胞苷酸、來(lái)蘇糖酸,1,4-內(nèi)脂的水平相對(duì)升高（變化倍數(shù)＞1）。

2.4 預(yù)測(cè)模型建立與評(píng)價(jià)（表3）

通過(guò)構(gòu)建不同Logistic 回歸模型并進(jìn)行評(píng)價(jià)與比較，按功效最優(yōu)原則，其中由性別、年齡、尿酸、色氨酸和尿素為組合的模型在模型構(gòu)建、內(nèi)部驗(yàn)證和外部驗(yàn)證時(shí)的AUC 值均較大，且擬合優(yōu)度檢驗(yàn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明該模型的預(yù)測(cè)能力和校準(zhǔn)能力均較好，確定為本研究預(yù)測(cè)模型。模型表達(dá)式為P=1/{1+exp[-（9.803-0.777×性別-0.204×年齡-0.343×ln 尿酸+0.024×ln 色氨酸+0.808×ln尿素）]}，其中P為發(fā)生血管內(nèi)皮功能障礙的概率預(yù)測(cè)值。

預(yù)測(cè)模型AUC 為0.974，95%CI 為0.945～1.000。以ROC 曲線中最靠近左上角的點(diǎn)為模型最佳截?cái)帱c(diǎn)，其對(duì)應(yīng)的概率預(yù)測(cè)值為0.666，敏感度和特異度分別為93.8%和93.3%。

表2 建模組中血管內(nèi)皮功能障礙者和正常者的血清差異代謝物

表3 建模組中血管內(nèi)皮功能障礙者和正常者的血清差異代謝物組合及模型構(gòu)建

2.5 預(yù)測(cè)模型驗(yàn)證

建模組十折交叉驗(yàn)證（內(nèi)部驗(yàn)證）平均AUC 為0.922（95%CI：0.847～0.997），敏感度和特異度分別為87.5%和91.1%（圖2）。十折交叉驗(yàn)證AUC 與模型構(gòu)建AUC 比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.07），提示預(yù)測(cè)模型具有良好的穩(wěn)定性。

運(yùn)用建立的預(yù)測(cè)模型對(duì)外部驗(yàn)證組26 例受試者進(jìn)行血管內(nèi)皮功能障礙預(yù)測(cè)。若P值≥0.666，則判定為血管內(nèi)皮功能障礙，反之則判定為血管內(nèi)皮功能正常。在金標(biāo)準(zhǔn)判定的12 例血管內(nèi)皮功能障礙者中，模型判定正確11 例，錯(cuò)分為血管內(nèi)皮功能正常者1 例；在金標(biāo)準(zhǔn)判定的14 例血管內(nèi)皮功能正常者中，模型判定正確11 例，錯(cuò)分為血管內(nèi)皮功能障礙者3 例。外部驗(yàn)證AUC 為0.881（95%CI：0.729～1.000），敏感度和特異度分別為91.7%和78.6%（圖2），表明模型的預(yù)測(cè)能力較好。

圖2 預(yù)測(cè)模型內(nèi)部驗(yàn)證和外部驗(yàn)證散點(diǎn)圖

3 討論

血管內(nèi)皮功能障礙的分子病理主要表現(xiàn)為一氧化氮（NO）生物利用度降低[12]，并常伴隨氧化應(yīng)激增加和炎癥反應(yīng)[13]。尿素是鳥(niǎo)氨酸循環(huán)的代謝產(chǎn)物，由精氨酸酶催化精氨酸生成。研究已表明，在動(dòng)脈粥樣硬化等以血管內(nèi)皮功能障礙為特征的疾病中，精氨酸酶活性增強(qiáng)[14-15]，尿素合成增多，而NO 合酶利用精氨酸生成NO 減少。尿酸是體內(nèi)一種強(qiáng)抗氧化劑，能清除自由基，維持抗氧化酶（超氧化物歧化酶）的活性[9]。此外，尿酸可與過(guò)氧亞硝酸鹽結(jié)合，防止NO 合酶必需輔酶因子—四氫生物蝶呤被氧化[16]。有研究報(bào)道，低水平尿酸可能通過(guò)增加氧化應(yīng)激和減少NO 生成而導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙[17]。色氨酸是人體必需氨基酸，在體內(nèi)主要通過(guò)犬尿氨酸途徑分解代謝。吲哚胺2,3 雙加氧酶（IDO）是控制色氨酸代謝的限速酶[18]。有研究表明，IDO 在炎癥反應(yīng)中上調(diào)[19]，色氨酸分解代謝增強(qiáng)，致其水平降低。因而，血清尿素、尿酸及色氨酸的改變可能與血管內(nèi)皮功能障礙的分子病理有關(guān)。

血管內(nèi)皮功能評(píng)價(jià)方法分為有創(chuàng)性和無(wú)創(chuàng)性，有創(chuàng)性方法包括冠狀動(dòng)脈內(nèi)注入血管活性物質(zhì)，血管內(nèi)超聲等。此類(lèi)方法可直接評(píng)估內(nèi)皮功能，測(cè)量結(jié)果可靠，但因?yàn)槭怯袆?chuàng)操作并且設(shè)備昂貴，使其廣泛應(yīng)用受到限制[20]。目前血管內(nèi)皮功能評(píng)價(jià)主要以無(wú)創(chuàng)性方法為主，常用的方法主要包括FMD，外周動(dòng)脈張力測(cè)定法（peripheral arterial tonometry,PAT），脈搏波傳導(dǎo)速度（PWV）檢測(cè)。FMD 檢測(cè)因具有無(wú)創(chuàng)性、安全性、可重復(fù)性的特點(diǎn)，以及對(duì)心血管病具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值而成為最常用的無(wú)創(chuàng)技術(shù)手段，但同時(shí)該檢測(cè)也存在設(shè)備昂貴、對(duì)操作者要求高、操作較為復(fù)雜與費(fèi)時(shí)等不足[20-21]。PAT 的技術(shù)原理與FMD 相似，具有自動(dòng)化檢測(cè)和對(duì)操作者依賴(lài)性小的優(yōu)勢(shì)，不足之處在于易受外界環(huán)境和自主神經(jīng)張力的影響[22]，檢測(cè)的敏感度和重復(fù)性不如FMD[23]。PWV 是通過(guò)測(cè)量體表兩個(gè)動(dòng)脈搏動(dòng)點(diǎn)之間的搏動(dòng)傳導(dǎo)速度評(píng)價(jià)內(nèi)皮功能，該方法操作簡(jiǎn)便，自動(dòng)化程度高，但其檢測(cè)過(guò)程費(fèi)時(shí)，重復(fù)性較低[24]。

雖然評(píng)價(jià)血管內(nèi)皮功能的方法眾多，但尚未有一種方法能同時(shí)滿足群體性現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查中簡(jiǎn)便、省時(shí)、不易受外界環(huán)境干擾的需求。目前也尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)血管內(nèi)皮功能障礙進(jìn)行預(yù)測(cè)的相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)GC-TOF-MS 技術(shù)檢測(cè)血清中代謝物，建立了由性別、年齡、尿酸、色氨酸和尿素為組成的血管內(nèi)皮功能障礙預(yù)測(cè)模型，模型總體上具有較好的穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)能力。GC-TOF-MS 技術(shù)可同時(shí)對(duì)多樣本多組分進(jìn)行檢測(cè)，樣本平均檢測(cè)時(shí)間和檢測(cè)成本均較低。在實(shí)際應(yīng)用中，只需獲取血液樣本進(jìn)行檢測(cè)即可預(yù)測(cè)，在一定程度上減少了對(duì)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)環(huán)境的依賴(lài)。

本研究存在以下不足。首先，用于模型構(gòu)建和驗(yàn)證的樣本量較少，將來(lái)預(yù)測(cè)模型仍需要更大的樣本量在不同特征的群體中進(jìn)行驗(yàn)證。其次，本次研究對(duì)象的納入標(biāo)準(zhǔn)為18～80 歲人群，但實(shí)際入組研究對(duì)象的平均年齡為（57.0±6.6）歲，并且主要是鄉(xiāng)鎮(zhèn)居民，因此該預(yù)測(cè)模型在應(yīng)用于年齡較小人群或城市居民時(shí)，可能存在一定的局限性。

綜上所述，本研究構(gòu)建的以性別、年齡、尿酸、色氨酸和尿素為組合的血管內(nèi)皮功能障礙預(yù)測(cè)模型具有良好的穩(wěn)定性和較強(qiáng)的預(yù)測(cè)能力。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突