脊髓和背根神經(jīng)節(jié)免疫組化制片的實踐和體會

免疫組織化學(xué)ABC法是一種古老而經(jīng)典的染色技術(shù)，由于敏感性高，操作時間短而被廣泛使用，也是研究生最常用的實驗方法之一[1]。免疫組化制片過程包括灌注、取材、切片和染色四個部分，任何一個環(huán)節(jié)的失誤都會影響到最終片子的質(zhì)量，從而影響實驗結(jié)果的展示。作者在研究生期間采用ABC法進(jìn)行了大量大鼠脊髓和背根神經(jīng)節(jié)（DRG）冰凍切片的免疫組化染色實驗，通過重視操作的每一個環(huán)節(jié)，改良優(yōu)化一些細(xì)節(jié)，使制作出的脊髓片和DRG片質(zhì)量大為提高，實驗結(jié)果更為精準(zhǔn)、美觀。以下是在實驗中總結(jié)出的一些心得體會。

1灌注的好壞直接影響了固定的質(zhì)量。

灌注是免疫組化實驗的第一步，主要包括兩個環(huán)節(jié)：灌注液的配制和灌注時的操作。

在我們實驗中通常配制含4%多聚甲醛的PB緩沖液作為灌注液，一般都能有較好的固定效果。但如果發(fā)現(xiàn)灌注后大鼠四肢不硬或取材脊髓太軟時，可通過在灌注液中添加50~75%的飽和苦味酸，增加灌注液的組織穿透性和增強組織韌性來解決。我們早期實驗中曾使用過一只十分難染的抗體TRPV4，在DRG中染色很多次都沒有陽性結(jié)果。一次降低灌注液的濃度至2%后，可見有明顯的陽性染色出現(xiàn)，因此適當(dāng)降低灌注液的甲醛濃度，是一種針對難染抗原的方法之一。

做好準(zhǔn)備工作后就可以進(jìn)行灌注了，此過程并不復(fù)雜，但如果操作不慎，也會導(dǎo)致灌注失敗，浪費辛苦所得的模型動物。在我們實驗中會注意以下一些細(xì)節(jié)，通常都能取得較高質(zhì)量的固定效果。①灌注前務(wù)必要徹底排盡管子內(nèi)的空氣和氣泡，這樣做主要是為了防止空氣栓塞于小血管，影響灌流液與組織的充分接觸。②在暴露心臟和升主動脈根部時不僅速度要快，而且視野要充分，盡量在心臟停跳后不久即完成灌注，促進(jìn)灌注液的流動。另外，穿刺時可先在心尖處剪一小口，這樣不僅能減少穿刺時的阻力，防止組織堵塞針頭，也可降低因血容量急劇增多引起末梢微血管破裂。同時應(yīng)注意穿刺時，針頭尖端進(jìn)入升主動脈內(nèi)1~2 mm即可（大鼠），不宜過長，以免因針頭頂住血管壁而增加灌流阻力；也不宜過短，否則部分灌注液可能會從心臟剪開的部位漏掉。③當(dāng)灌注液進(jìn)入體內(nèi)后，大鼠出現(xiàn)四肢明顯抽搐，肝臟發(fā)白，以及內(nèi)臟鼓起即表明灌注成功。如果初次灌注或操作不熟練造成組織固定效果不好時，可將組織置于灌注時的同一灌注液中4~6 h，進(jìn)行后固定以增加固定效果，但后固定的時間不要超過24 h，否則會形成結(jié)晶，影響染色結(jié)果。

2取材時組織的完整性對于標(biāo)本的美觀十分重要。

脊髓取材相對較為簡單，注意操作時器械尖端緊貼椎骨一點點掀開骨片，避免劃傷組織即可。但是DRG由于位于椎間孔內(nèi)，標(biāo)本小且位置深，直接去椎骨取材常易損傷DRG組織。因此，我們采用沿坐骨神經(jīng)逆行追蹤L4和L5神經(jīng)至椎間孔，再沿神經(jīng)走行方向用力將DRG從椎間孔拉出的方式進(jìn)行取材，這樣既能保證DRG結(jié)構(gòu)的完整性，在熟練掌握的基礎(chǔ)上也相對簡單易行。而且即使神經(jīng)被拉斷，仍可通過掀開椎骨的方式取出DRG。需注意的是：如同時需要脊髓組織時，務(wù)必先取脊髓后拉DRG，否則會因牽拉對脊髓組織造成一定的損傷。

取材后的脊髓或DRG需在30%的蔗糖溶液中放置至組織沉底，目的是將組織中的水分充分置換出，以減少在冰凍時形成冰晶損傷組織。但蔗糖溶液易生霉菌，若要較長時間保存組織則必須在溶液中加入0.03%的疊氮鈉，否則會使組織發(fā)生霉變而無法使用。

3切片的質(zhì)量是染色的前提。

神經(jīng)組織多采用冰凍切片。由于在組織凍結(jié)過程中，細(xì)胞內(nèi)、外的水分都會形成冰晶，且凍結(jié)速度越慢，形成的冰晶越大，對組織和細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的損害也就越嚴(yán)重。因此我們會在凍結(jié)前將組織浸埋于OCT包埋劑中，再速凍到-20℃，以達(dá)到盡量減少冰晶形成，且支撐組織的目的。在此過程中，包埋劑的使用既不能過多也不能太少，太少不能起到對組織的支撐作用，使切片時組織容易出現(xiàn)皺褶或碎裂，但太多也會增加切片后的漂洗過程，更為重要的是由于包埋劑和組織的硬度不同，容易在切片過程中帶離部分或全部組織，造成切片失敗。

脊髓的實驗常采用連續(xù)冠狀切片，而DRG因組織小，為了得到最大組織截面通常采用矢狀切片，且將片厚減小到10 μm以增加切片數(shù)量。但是由于切片薄，面積小且纖維較多，如果像脊髓片那樣進(jìn)行漂片染色，則可能會因漂洗過程反復(fù)挑起組織而造成損傷，而且染色結(jié)束后很難保證DRG片的平整，影響鏡下觀察。因此在我們的實驗中DRG片均是在切片后即貼片。不僅如此，我們還進(jìn)行連續(xù)貼片，通常一個大鼠的DRG可以連續(xù)貼出6張載玻片，每張玻片上4~5個DRG片，這樣做目的是為了得到6套結(jié)構(gòu)基本相似的DRG玻片，有利于進(jìn)行相似結(jié)構(gòu)不同抗體的對比實驗。然而，貼片染色最大的問題就在于反復(fù)漂洗等過程中容易脫片，因此對載玻片的前期處理就顯得格外重要。我們實驗中對新購的載玻片依次要經(jīng)過泡酸、自來水清洗、洗潔精搓洗、雙蒸水清洗、逐一掛膠、烤干、再逐一掛膠、再烤干等步驟，目的是使載玻片具有較好的粘附性；在使用時要挑選光潔無膠痕的掛膠片用來貼片，只有這樣才能盡可能地減少脫片的幾率。此外，如果經(jīng)費充足，也可直接購買用賴氨酸包被好的載玻片進(jìn)行貼片。

4染色的質(zhì)量直接決定了免疫組化的結(jié)果。

染色是免疫組化制片過程中的最后一步，也是最關(guān)鍵的一步。為了保證染色的效果，我們通常會將標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理：用H2O2去除組織中的過氧化物酶，以及用血清封閉非特異性抗原。但需注意H2O2處理時應(yīng)注意時間和避光，若長時間H2O2浸泡，會使組織易破碎，而不避光則會使H2O2分解失效。

預(yù)處理之后就是加入抗體進(jìn)行染色的步驟了，該過程一般需經(jīng)3次抗體孵育，其中第一抗體最為重要，它將特異性地結(jié)合組織中的抗原。由于通常購買的第一抗體大多都是多克隆抗體，往往會出現(xiàn)非特異性染色，因此確定抗體染色最佳濃度就顯得至關(guān)重要。那么如何確定抗體最佳濃度呢？最簡單的方法當(dāng)然是借鑒前人的使用結(jié)果。但很多時候?qū)嶒炛袝褂玫叫沦徔贵w，這時就只能采用抗體梯度稀釋染色的方法，篩選出染色效果最好的抗體工作濃度進(jìn)行后續(xù)實驗。另外在染色過程中還需注意抗體的孵育時間。第一抗體的孵育時間通常<24 h，生物素結(jié)合的二抗6~8 h，AB復(fù)合物則2 h左右即可。然而對于一些不易染出的抗體，可將孵育時間均適當(dāng)延長，如一抗延長至72 h，以增加抗體與抗原的充分作用。但是孵育時間長，非特異性染色也會增多，為此最好在4℃條件下孵育抗體（除AB復(fù)合物外），這樣在增加抗體作用時間的同時并不會增強染色背底。

抗體孵育后的顯色一般是用DAB作用5~10 min，并加入少量H2O2加速反應(yīng)。此過程中H2O2的加入應(yīng)少量多次逐步加入，這樣顯色才能均勻；此外若無陽性結(jié)果時也不必過度延長DAB顯色時間，因加入DAB后一段時間，陽性產(chǎn)物是不會隨著時間延長而繼續(xù)增多的。

5實驗中主要存在的問題和解決辦法

對脊髓片和DRG片免疫組化制片實驗中的問題進(jìn)行總結(jié)，主要包括兩個方面：①沒有陽性結(jié)果：可能原因主要有抗體質(zhì)量不好或工作濃度不合適、標(biāo)本放置時間太久等。除了抗體質(zhì)量問題外，其余都可在實驗中通過摸索條件來解決。而抗體質(zhì)量不好則最難解決，可先通過降低灌注液濃度、對組織進(jìn)行抗原修復(fù)、延長抗體孵育時間或適當(dāng)提高抗體濃度等方法，若仍舊無法染出陽性結(jié)果，則最好盡快更換抗體，以免浪費實驗時間。②有陽性結(jié)果但質(zhì)量不好：質(zhì)量不好分為兩種：一種是標(biāo)本中出現(xiàn)明顯空洞或標(biāo)本殘缺，這可能是浸糖時間不夠，蔗糖脫水不充分；或取材、漂片時動作過于粗暴所致，這些問題比較容易解決。而另一種則是出現(xiàn)假陽性、非特異性染色或?qū)Ρ榷炔缓玫?，這通常是因第一抗體工作濃度過高、漂洗不充分、血清封閉不夠或DAB反應(yīng)時間太長所致，因此預(yù)實驗就顯得格外重要。

免疫組化ABC法雖然技術(shù)古老，操作簡單，然而要得到高質(zhì)量的脊髓片或DRG片，卻并非易事。研究生在實驗中應(yīng)重視細(xì)節(jié)操作，在掌握原理的基礎(chǔ)上進(jìn)行合理改良，不僅能得到滿意的實驗結(jié)果，也能更好地培養(yǎng)和提高研究生的科研素質(zhì)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李云慶. 神經(jīng)解剖學(xué)[M]. 西安:第四軍醫(yī)大學(xué)出版社， 2011: 60-66.

編輯/王海靜