肝藥酶CYP3A1在四氯化碳誘導肝纖維化大鼠肝臟的表達

摘要：目的 觀察四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）誘導的肝纖維化大鼠肝臟P450亞型CYP3A1表達的變化。方法 雄性SD大鼠采用10%四氯化碳誘導肝纖維化模型（1ml/kg， 2次/w，共12w），收集大鼠外周血和肝臟；石蠟切片的HE染色觀察大鼠肝臟的病理學改變；外周血離心獲得血清后檢測肝功能指標ALT、AST；Real time RT-PCR檢測肝纖維化大鼠肝臟組織中CYP3A1的mRNA表達。結果 四氯化碳誘導的肝纖維化大鼠肝臟HE染色可見明顯纖維化改變，外周血的肝功能生化檢測顯示肝纖維化大鼠的ALT和AST較空白對照組顯著升高（P<0.05）；而Real time RT-PCR檢測結果顯示四氯化碳誘導的肝纖維化大鼠肝臟中CYP3A1 mRNA的表達較空白對照組明顯降低（P<0.05）。結論 肝藥酶CYP3A1在四氯化碳誘導的肝纖維化大鼠肝臟中的表達是降低的。

關鍵詞：肝纖維化；CYP3A1；大鼠

Expression of CYP3A1 in the Liver of Hepatic Fibrosis Induced by CCl4 in Rat

XU Shang-fu1， LI Jin2*， HOU Wei-yu1， ZHU Qiong-ni1， LU Yuan-fu1， LIU Jie1

(1. Department of Pharmacology/The Key Laboratory for Basic Pharmacology of Ministry of Education， Zunyi 563000， Guizhou，China; 2. Research Center for Medicine and Biology of Zunyi Medical College， Zunyi 563000， Guizhou，China)

Abstract：Objective To observe the expression of CYP3A1 in the liver of hepatic fibrosis induced by CCl4 in rats. Methods SD rats were hypodermic injected 10% CCl4 to induce hepatic fibrosis model (1ml/kg， 2 times / week， for 12 weeks). Peripheral blood and liver tissue were collected. Paraffin sections stained with HE to observe the pathological changes of rat liver and hepatic function index of ALT and AST in peripheral blood serum after centrifugation. Expression of CYP3A1 mRNA was detected in liver fibrosis in rat liver tissue by Real time RT-PCR. Results HE staining of CCl4 induced hepatic fibrosis rat liver showed obvious fibrosis and liver function biochemical detection of peripheral blood showed ALT and ASTincreased significantly than the control group in hepatic fibrosis in rats(P < 0.05). Real time RT-PCR detection showed that compared with control group the expression of CYP3A1 mRNA decreased significantly in CCl4 induced hepatic fibrosis in rat liver (P< 0.05). Conclusion The expression of CYP3A1 of hepatic enzymes was reduced in CCl4 induced liver fibrosis in rats.

Key words：Hepatic fibrosis; CYP3A1；Rat肝細胞色素酶P450（Cytochrome P450， CYP450）簡稱肝藥酶，又稱藥物代謝酶，是體內參與藥物代謝的主要酶系，主要存在于肝臟，由結構和功能相關的基因超家族亞型組成，主要包括CYP1、2、3、4四個家族。研究表明，進入人體的藥物約90%都要通過肝微粒體系酶細胞色素P450酶的代謝，尤其是CYP3A4。CYP3A4在大鼠體內主要表現(xiàn)為同工酶CYP3A1，在藥物代謝過程中起到重要作用[1]。肝纖維化形成過程中伴隨著肝臟細胞的損傷、再生和壞死，P450相關基因的表達也收到影響[2]，但作者尚未見有關肝纖維化形成后對藥物代謝酶亞型CYP3A1表達影響的報道。因此，本實驗研究四氯化碳誘導的肝纖維化大鼠肝臟中CYP3A1的表達，為肝纖維化的臨床用藥提供基礎藥理學依據(jù)。

1資料與方法

1.1主要試劑和儀器四氯化碳購自阿拉丁化學試劑有限公司（批號：20110513），橄欖油購自國藥集團化學試劑有限公司（批號：20120125），Trizol、逆轉錄試劑盒、PCR熒光（SYBR Green）預混液均購自寶生物（大連）有限公司，ALT和AST檢測試劑盒購自南京建成生物技術有限公司；Real time RT-PCR儀為美國BIO-RAD公司產(chǎn)品（型號：CFX-connect）。

1.2實驗動物和分組給藥 SD大鼠20只，雄性，體重（260±20）g，隨機分為兩組，空白對照組（control）和肝纖維化組（hepatic fibrosis），大鼠合格證號：SCXK（渝）2012-0005。肝纖維化組大鼠每周給予10%四氯化碳1m/kg皮下注射，空白對照組給予等量生理鹽水，共12w。

1.3肝臟病理學檢測常規(guī)石蠟包埋切片，二甲苯脫蠟，行蘇木素染色和伊紅染色（HE）。常規(guī)脫水透明，封片，顯微鏡觀察。

1.4肝功能檢測采用谷丙轉氨酶(ALT)測定試劑盒、谷草轉氨酶(AST)測定試劑盒測定血清中的ALT、AST，步驟參見試劑盒說明完成。

1.5 Real time RT-PCR檢測大鼠肝臟CYP3A1 mRNA的表達 肝臟50mg 用Trizol勻漿抽提總RNA，采用SYBR Green法進行Real time RT-PCR，CYP3A1的特異性引物有寶生物（大連）有限公司設計合成。引物序列（5-3排列）如下，CYP3A1上游：agtggggattatggggaaag，下游：caggtttgcctttctcttgc；β-actin上游：ggagattactgccctggctccta，下游：gactcatcgtactcctgcttgctg。以β-actin為內參，結果采用相對定量法進行分析[3]。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計所有數(shù)據(jù)以（x±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05認為具有統(tǒng)計學差異。

2結果

2.1大鼠肝臟形態(tài)學檢測和肝功能檢測結果結果如圖1顯示，四氯化碳誘導的肝纖維化大鼠肝臟與正常對照組比較，肝小葉失去正常結構，多數(shù)肝細胞發(fā)生脂肪變性，匯管區(qū)及中央靜脈周圍大量炎性細胞侵潤，膠原纖維增生，有假小葉形成。并且肝功能結果顯示ALT和AST顯著升高（P<0.05）。

圖1四氯化碳誘導的肝纖維化大鼠肝臟病理學改變與肝功能功能結果。（x±s，n=10，vs control，**P<0.01）

2.2大鼠肝臟CYP3A1 mRNA檢測結果Real time RT-PCR結果可見表1，四氯化碳誘導的大鼠肝纖維化組織中肝藥酶CYP3A1表達明顯降低（P<0.05）。

3討論

肝纖維化（hepatic fibrosis）是肝臟對慢性損傷的修復反應，其化學本質是細胞外基質過度沉積，其中化學或藥物性損傷是重要原因[4]。四氯化碳是復制肝纖維化動物模型最常用藥物，可發(fā)生一些列化學反應，生成三氯甲基自由基攻擊肝臟而引起損傷，使肝細胞壞死，轉氨酶 ALT和 AST異常增高[5]。本研究亦采用四氯化碳誘導大鼠肝纖維化模型，從肝臟病理學改變和肝功能檢測證實模型制備成功。

CYP3A 亞家族是P450家族的主要成員，大約參與50%臨床常用藥物的代謝，在內源性物質和藥物的代謝中起重要作用，如抗腫瘤藥物紫杉醇 長春花堿以及伊立替康、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、吉非替尼等都是 CYP3A家族CYP3A4亞型的代謝底物[6]，大鼠相應的亞型是 CYP3A1。CYP3A1是大鼠體內重要的代謝酶，但隨著肝纖維化的形成，代謝酶的活性及mRNA的表達也發(fā)生著變化。有研究報道在四氯化碳誘導的大鼠急性肝損傷模型中，CYP3A1 被誘導且mRNA表達水平升高[5]；也有研究認為四氯化碳的作用會使CYP3A1 mRNA表達降低[7]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在給予大鼠四氯化碳12個月后，隨著大鼠肝纖維化的形成，CYP3A1的表達是降低的，可能與四氯化碳長期作用而使肝細胞中酶活性降低有關，但需要進一步多時間點觀察研究。

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編輯/哈濤