抗氧化劑在缺血再灌注損傷中對大鼠腸粘膜的保護(hù)作用

摘要：目的 探討預(yù)先腸道給予抗氧化劑對大鼠腸缺血再灌注損傷小腸粘膜的保護(hù)作用。方法 使用75只成年雄性SD大鼠，采用生理鹽水、維生素C、維生素E和后兩者的組合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)。依據(jù)腸血管供應(yīng)游離腸管，通過夾閉供應(yīng)該段腸管的血管進(jìn)行缺血再灌注造模。在未夾閉、缺血末期及再灌注期每15min取材。分時(shí)段取材后進(jìn)行定量、定性分析。結(jié)果 與其他組比較，使用維生素E組和維生素E、維生素C聯(lián)合組呈顯著衰減缺血再灌注損傷作用。最后研究表明以上兩組與控制組和維生素C組比較，能顯著的減少絨毛高度的降低及中性粒細(xì)胞的浸潤。結(jié)論 在缺血再灌注實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，維生素E做前期處理能夠減弱I/R對大鼠小腸粘膜的損傷，減少絨毛高度的降低、衰減中性粒細(xì)胞的浸潤。

關(guān)鍵詞：缺血；再灌注；再灌注損傷；抗氧化劑缺血組織血流量恢復(fù)會造成比原先缺血引起更大的損傷，這個(gè)過程稱為缺血再灌注（I/R）損傷。I/R時(shí)，小腸是最容易受損傷的。雖然所涉及的機(jī)制尚未完全闡明，但相信，氧化應(yīng)激的炎癥介質(zhì)發(fā)揮重要的作用。由于超氧化物（ROS）參與I/R損傷的發(fā)生，多種抗氧化劑都進(jìn)行過研究，其中就包括維生素C、維生素E。維生素C是一種水溶性、還原性的抗氧化劑，常被用來對抗I/R造成的損傷。維生素E是一種脂溶性抗氧化劑，通過穩(wěn)定細(xì)胞膜的不飽和脂肪酸的來對抗氧化應(yīng)激反應(yīng)。因此，維生素E能減少組織ROS反應(yīng)，增加組織抵抗膜質(zhì)過氧化的作用，維生素C、E聯(lián)合應(yīng)用有協(xié)同效應(yīng)。本研究的目的是用維生素C、E前期處理實(shí)驗(yàn)大鼠，通過空腸的形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)來評估其對I/R小腸粘膜的積極作用。

1資料與方法

1.1空腸缺血再灌注模型使用75只體重介于224~261g的成年健康雄性SD大鼠，腹腔注射氯胺酮麻醉后剖腹探查。游離腸系膜動(dòng)、靜脈，長度足夠放置血管夾即可。以游離動(dòng)脈供應(yīng)的腸段作為取材部位。在未夾閉血管前取材一次（BC）。為了避免其他因素影響小腸絨毛的高度，達(dá)到徹底地模型效應(yīng)，游離腸段3cm左右，并切斷所有的側(cè)支循環(huán)。夾閉腸管血管1h后，進(jìn)行第2次取材（BI），后移去血管夾，恢復(fù)血流，分別在再灌注15min（RB15）、30min（RB30）、45min（RB45）和60min的（RB60）取材。

1.2實(shí)驗(yàn)分組75只大鼠隨機(jī)分為5組：T組大鼠行剖腹探查并切除選定腸管，不做缺血再灌注損傷模型。對照組行剖腹探查術(shù)，并行腸管缺血再灌注造模，預(yù)定時(shí)間點(diǎn)取材，沒有預(yù)先處理。C組造模，術(shù)前4d通過喂養(yǎng)的方式給予250mg/kg維生素C。E組也造模，術(shù)前4d與C組相同的方式給予60mg/kg維生素E。C+E組行與對照組相同的手術(shù)，并喂養(yǎng)與C組、E組相同計(jì)量的兩種藥物。

1.3損傷的指標(biāo)用定量分析方法來評估缺血再灌注的損傷。腸管損傷程度用組織切片絨毛的高度、中性粒細(xì)胞浸潤的程度來評價(jià)。為減小誤差及偏倚，所有標(biāo)本由本實(shí)驗(yàn)室被雙盲的技術(shù)人員用Chiu等人提出的分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評估。使用光學(xué)顯微鏡在10個(gè)隨機(jī)鏡頭視野統(tǒng)計(jì)絨毛的高度分布，單位為毫米（mm）。通過在20個(gè)隨機(jī)域內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤數(shù)量來評估評價(jià)其浸潤、損傷程度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)采用（x±s）表示。采用Spearman and Pearson檢測評估變量之間的相關(guān)性。多因素比較采用方差分析（ANOVA）。P值< 0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 絨毛高度 數(shù)據(jù)顯示隨時(shí)間絨毛的高度逐漸降低（表2）。整體比較發(fā)現(xiàn)取材點(diǎn)與絨毛高度有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的相關(guān)性。見表1。

在每一組不同的時(shí)間點(diǎn)、不同組的相同時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行絨毛高度的比較。首先，在對照組，絨毛的高度從BC的（363.55±35.89）減少到RB60的（129.16±27.17），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。與RB15比較也是有顯著性差異的，RB15的絨毛高度為（296.87±46.13），P=0.004（表2）。在C組，相同的是，與RB15的比較有顯著性差異（P<0.001）。E組的絨毛平均高度從BC的（343.93±46.79）減少到RB60的（154.12±31.88）（P<0.001），與BI的比較有顯著性差異P<0.001（表2）。使用與E組相同的方式比較同時(shí)使用維生素C+E的大鼠組，平均腸絨毛的高度從BC的（332.37±48.96）減少到RB60的（156.23±29.63）（P<0.001），并且與B1的比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.001（表2）。在相同的取材時(shí)間點(diǎn)中，回腸平均絨毛高度從對照組的（363.55±35.89）到E+C組的（332.37±42.00）沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.235，表2）。在B1時(shí)，當(dāng)對照組（338.53±45.08）與E組（249.00±35.34，P<0.001）和C+E組（240.07±44.26）比較時(shí)，有顯著的差異，P<0.001。在RB15，對照組（296.87±46.13）和C+E組（230.99±46.38）之比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P= 0.029。在RB30，C+E組與對照組有顯著差異（P<0.001），在RB45，與C+E組（P=0.020）和E組（P=0.037）這種差異仍然存在，在RB60，與E組為P=0.032、C+E組為P=0.025。見表2。

2.2中性粒細(xì)胞浸潤再灌注期間，中性粒細(xì)胞浸潤的數(shù)量呈進(jìn)行性增加（表3）。依據(jù)不同的時(shí)間段及處理，對中性粒細(xì)胞在黏膜、黏膜下層浸潤的數(shù)量進(jìn)行比較，取材的時(shí)間段與中性粒細(xì)胞浸潤數(shù)量之間有顯著的相關(guān)性。見表3。

在所有的分組中，中性粒細(xì)胞數(shù)量都是遞增的。對于RB30，這種增長在對照組與E組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在C組與C+E組做比較時(shí)，RB15點(diǎn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。在BI、BC，各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在RB15、RB30，當(dāng)C組、C+E組與E組及對照組比較時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。在RB45，各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.2087）。在RB60，C組、E組和C+E組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表4）。

3討論

維生素C因其抗氧化作用被廣泛用于缺血再灌注損傷中。一項(xiàng)使用維生素C的兔子實(shí)驗(yàn)研究，證明其與甘露醇、N-乙酰半胱氨酸能改善腸系膜動(dòng)脈血流。但是在小腸微觀結(jié)構(gòu)中只有維生素C、甘露醇有直接的保護(hù)作用，顯著減少缺血再灌注損傷 。另一項(xiàng)研究評估維生素E的抗氧化作用，通過測量腸黏膜丙二醛、谷胱甘肽的含量，將其作為定性的病理評分。它表明維生素C和甘露醇有黏膜保護(hù)作用，減少胃黏膜的損傷及丙二醛的積累。然而，在維生素E的使用上，在這些檢測數(shù)據(jù)并沒有差異。據(jù)此作者認(rèn)為，由于維生素C和甘露醇的有效性和易用性可能有助于預(yù)防腸道的缺血再灌注損傷。這兩篇都使用維生素C靜脈注射，顯示出其適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)作用。在我們的研究中，我們可以找出在定量上的顯著性差異。有學(xué)者的研究結(jié)果表明，在手術(shù)缺血階段的維生素C能促進(jìn)鐵誘導(dǎo)的脂質(zhì)氧化損傷。在治療劑量方面，較小劑量的維生素C因?yàn)樵黾友装Y反應(yīng)而在治療缺血再灌注損傷上有負(fù)面影響。在血清、粘膜的檢測中證明使用維生素C防止脂質(zhì)過氧化是無效的。

在缺血前使用維生素E表現(xiàn)出對I / R損傷大鼠肝臟生化、組織病理的保護(hù)作用。術(shù)前用藥也被證明是一種有效減少再灌注損傷的方法。有臨床研究，外科手術(shù)前靜脈注射維生素E顯著降低肝缺血再灌注損傷，具有良好的安全性，并減少血液肝相關(guān)酶的濃度、縮短ICU停留時(shí)間。在人體內(nèi)，維生素C、維生素E降低氧化應(yīng)激的反應(yīng)。心肌梗死的患者，再灌注后維生素E的水平顯著下降，而再灌注失敗的患者不出現(xiàn)。對于血清中的維生素C水平，這兩種情況下沒有什么區(qū)別。維生素E的消耗證明心肌梗死后心肌處在再灌注階段，這是心肌梗死再灌注的標(biāo)志性指標(biāo)。

在再灌注期間粘膜中的中性粒細(xì)胞浸潤的數(shù)量增加，并與腸道損傷相平行。維生素C、E都證實(shí)能降低肺I/R損傷，但不能防止發(fā)生，因?yàn)樗鼈円种浦行粤＜?xì)胞的激活，但不能抑制其他來源的活性氧化物的生產(chǎn)。在大鼠回腸，聯(lián)合使用維生素C、E表現(xiàn)出良好的效應(yīng)，增加腸管的活性。在這項(xiàng)研究中，E組和C+ E組有較高的絨毛高度、較少的中性粒細(xì)胞浸潤，表明粘膜損傷與中性粒細(xì)胞浸潤的密切相關(guān)性。

在本研究中，再灌注期，絨毛高度逐步減少、中性粒細(xì)胞浸潤增加，而且給予維生素E或維生素C+E能減輕粘膜損傷有重要意義。在我們的研究中，一項(xiàng)重要的意義就是在個(gè)分組中觀察中性粒細(xì)胞的浸潤，同樣是不同的實(shí)驗(yàn)處理得到不同的浸潤程度。在再灌注的后期，E組與C+E組腸粘膜內(nèi)中性粒細(xì)胞的浸潤明顯減少。

據(jù)上分析推斷：術(shù)前給予維生素E等還原性活性物，能夠減輕大鼠小腸粘膜缺血再灌注損傷。這種術(shù)前處理安全又簡單易行。實(shí)驗(yàn)中證明單獨(dú)使用維生素C沒有明顯的積極意義。

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