肝藥酶CYP3A1在四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化大鼠肝臟的表達(dá)

摘要：目的 觀察四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝臟P450亞型CYP3A1表達(dá)的變化。方法 雄性SD大鼠采用10%四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化模型（1ml/kg， 2次/w，共12w），收集大鼠外周血和肝臟；石蠟切片的HE染色觀察大鼠肝臟的病理學(xué)改變；外周血離心獲得血清后檢測(cè)肝功能指標(biāo)ALT、AST；Real time RT-PCR檢測(cè)肝纖維化大鼠肝臟組織中CYP3A1的mRNA表達(dá)。結(jié)果 四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝臟HE染色可見(jiàn)明顯纖維化改變，外周血的肝功能生化檢測(cè)顯示肝纖維化大鼠的ALT和AST較空白對(duì)照組顯著升高（P<0.05）；而Real time RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝臟中CYP3A1 mRNA的表達(dá)較空白對(duì)照組明顯降低（P<0.05）。結(jié)論 肝藥酶CYP3A1在四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝臟中的表達(dá)是降低的。

關(guān)鍵詞：肝纖維化；CYP3A1；大鼠

Expression of CYP3A1 in the Liver of Hepatic Fibrosis Induced by CCl4 in Rat

XU Shang-fu1， LI Jin2*， HOU Wei-yu1， ZHU Qiong-ni1， LU Yuan-fu1， LIU Jie1

(1. Department of Pharmacology/The Key Laboratory for Basic Pharmacology of Ministry of Education， Zunyi 563000， Guizhou，China; 2. Research Center for Medicine and Biology of Zunyi Medical College， Zunyi 563000， Guizhou，China)

Abstract：Objective To observe the expression of CYP3A1 in the liver of hepatic fibrosis induced by CCl4 in rats. Methods SD rats were hypodermic injected 10% CCl4 to induce hepatic fibrosis model (1ml/kg， 2 times / week， for 12 weeks). Peripheral blood and liver tissue were collected. Paraffin sections stained with HE to observe the pathological changes of rat liver and hepatic function index of ALT and AST in peripheral blood serum after centrifugation. Expression of CYP3A1 mRNA was detected in liver fibrosis in rat liver tissue by Real time RT-PCR. Results HE staining of CCl4 induced hepatic fibrosis rat liver showed obvious fibrosis and liver function biochemical detection of peripheral blood showed ALT and ASTincreased significantly than the control group in hepatic fibrosis in rats(P < 0.05). Real time RT-PCR detection showed that compared with control group the expression of CYP3A1 mRNA decreased significantly in CCl4 induced hepatic fibrosis in rat liver (P< 0.05). Conclusion The expression of CYP3A1 of hepatic enzymes was reduced in CCl4 induced liver fibrosis in rats.

Key words：Hepatic fibrosis; CYP3A1；Rat肝細(xì)胞色素酶P450（Cytochrome P450， CYP450）簡(jiǎn)稱肝藥酶，又稱藥物代謝酶，是體內(nèi)參與藥物代謝的主要酶系，主要存在于肝臟，由結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的基因超家族亞型組成，主要包括CYP1、2、3、4四個(gè)家族。研究表明，進(jìn)入人體的藥物約90%都要通過(guò)肝微粒體系酶細(xì)胞色素P450酶的代謝，尤其是CYP3A4。CYP3A4在大鼠體內(nèi)主要表現(xiàn)為同工酶CYP3A1，在藥物代謝過(guò)程中起到重要作用[1]。肝纖維化形成過(guò)程中伴隨著肝臟細(xì)胞的損傷、再生和壞死，P450相關(guān)基因的表達(dá)也收到影響[2]，但作者尚未見(jiàn)有關(guān)肝纖維化形成后對(duì)藥物代謝酶亞型CYP3A1表達(dá)影響的報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)研究四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝臟中CYP3A1的表達(dá)，為肝纖維化的臨床用藥提供基礎(chǔ)藥理學(xué)依據(jù)。

1資料與方法

1.1主要試劑和儀器四氯化碳購(gòu)自阿拉丁化學(xué)試劑有限公司（批號(hào)：20110513），橄欖油購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（批號(hào)：20120125），Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR熒光（SYBR Green）預(yù)混液均購(gòu)自寶生物（大連）有限公司，ALT和AST檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物技術(shù)有限公司；Real time RT-PCR儀為美國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)品（型號(hào)：CFX-connect）。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組給藥 SD大鼠20只，雄性，體重（260±20）g，隨機(jī)分為兩組，空白對(duì)照組（control）和肝纖維化組（hepatic fibrosis），大鼠合格證號(hào)：SCXK（渝）2012-0005。肝纖維化組大鼠每周給予10%四氯化碳1m/kg皮下注射，空白對(duì)照組給予等量生理鹽水，共12w。

1.3肝臟病理學(xué)檢測(cè)常規(guī)石蠟包埋切片，二甲苯脫蠟，行蘇木素染色和伊紅染色（HE）。常規(guī)脫水透明，封片，顯微鏡觀察。

1.4肝功能檢測(cè)采用谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測(cè)定試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)測(cè)定試劑盒測(cè)定血清中的ALT、AST，步驟參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明完成。

1.5 Real time RT-PCR檢測(cè)大鼠肝臟CYP3A1 mRNA的表達(dá) 肝臟50mg 用Trizol勻漿抽提總RNA，采用SYBR Green法進(jìn)行Real time RT-PCR，CYP3A1的特異性引物有寶生物（大連）有限公司設(shè)計(jì)合成。引物序列（5-3排列）如下，CYP3A1上游：agtggggattatggggaaag，下游：caggtttgcctttctcttgc；β-actin上游：ggagattactgccctggctccta，下游：gactcatcgtactcctgcttgctg。以β-actin為內(nèi)參，結(jié)果采用相對(duì)定量法進(jìn)行分析[3]。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)所有數(shù)據(jù)以（x±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2結(jié)果

2.1大鼠肝臟形態(tài)學(xué)檢測(cè)和肝功能檢測(cè)結(jié)果結(jié)果如圖1顯示，四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝臟與正常對(duì)照組比較，肝小葉失去正常結(jié)構(gòu)，多數(shù)肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性，匯管區(qū)及中央靜脈周圍大量炎性細(xì)胞侵潤(rùn)，膠原纖維增生，有假小葉形成。并且肝功能結(jié)果顯示ALT和AST顯著升高（P<0.05）。

圖1四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝臟病理學(xué)改變與肝功能功能結(jié)果。（x±s，n=10，vs control，**P<0.01）

2.2大鼠肝臟CYP3A1 mRNA檢測(cè)結(jié)果Real time RT-PCR結(jié)果可見(jiàn)表1，四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化組織中肝藥酶CYP3A1表達(dá)明顯降低（P<0.05）。

3討論

肝纖維化（hepatic fibrosis）是肝臟對(duì)慢性損傷的修復(fù)反應(yīng)，其化學(xué)本質(zhì)是細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積，其中化學(xué)或藥物性損傷是重要原因[4]。四氯化碳是復(fù)制肝纖維化動(dòng)物模型最常用藥物，可發(fā)生一些列化學(xué)反應(yīng)，生成三氯甲基自由基攻擊肝臟而引起損傷，使肝細(xì)胞壞死，轉(zhuǎn)氨酶 ALT和 AST異常增高[5]。本研究亦采用四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型，從肝臟病理學(xué)改變和肝功能檢測(cè)證實(shí)模型制備成功。

CYP3A 亞家族是P450家族的主要成員，大約參與50%臨床常用藥物的代謝，在內(nèi)源性物質(zhì)和藥物的代謝中起重要作用，如抗腫瘤藥物紫杉醇 長(zhǎng)春花堿以及伊立替康、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、吉非替尼等都是 CYP3A家族CYP3A4亞型的代謝底物[6]，大鼠相應(yīng)的亞型是 CYP3A1。CYP3A1是大鼠體內(nèi)重要的代謝酶，但隨著肝纖維化的形成，代謝酶的活性及mRNA的表達(dá)也發(fā)生著變化。有研究報(bào)道在四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷模型中，CYP3A1 被誘導(dǎo)且mRNA表達(dá)水平升高[5]；也有研究認(rèn)為四氯化碳的作用會(huì)使CYP3A1 mRNA表達(dá)降低[7]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在給予大鼠四氯化碳12個(gè)月后，隨著大鼠肝纖維化的形成，CYP3A1的表達(dá)是降低的，可能與四氯化碳長(zhǎng)期作用而使肝細(xì)胞中酶活性降低有關(guān)，但需要進(jìn)一步多時(shí)間點(diǎn)觀察研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]王廣基，主編. 藥物代謝動(dòng)力學(xué)[M]. 化學(xué)工業(yè)出版社， 2005:45.

[2]Ingenman SM. Pharmacogenetics of cytochrome P450 and its applications in drug therapy: the past present and future [J]. Trends PharmacolSci， 2004， 25(4): 193-200.

[3]Shang-Fu Xu， Li-Mei Yu， Zhen-Hai Fan， et al. Improvement of ginsenoside Rg1 on hematopoietic function in cyclophosphamide-induced myelosuppression mice [J]. European Journal of Pharmacology， 2012; 695: 7-12.

[4]曹春輝，潘玲，馮廣帥， 等. 經(jīng)方治療肝纖維化研究進(jìn)展[J]. 實(shí)用中醫(yī)藥雜志， 2013， 29(11): 970-972.

[5]洪振豐，李天驕， 趙錦燕， 等. 粗葉懸鉤子總生物堿對(duì)急性肝損傷大鼠肝組織CYP2E1與CYP3A1酶mRNA表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志， 2009， 29(8): 711-715.

[6]劉韜， 鄧多， 林子超， 等. 升板方對(duì)SD大鼠CYP3A1酶活性的影響. 中藥材， 2012， 35(2): 254-259.

[7]Kier LD， Neft R， Tang L， et al. Applications of microarrays with toxicologically relevant genes (tox genes) for the evaluation of chemical toxicants in Sprague Dawley rats in vivo and human hepatocytes in vitro [J]. Mutat Res， 2004， 549(1-2):101-113.

編輯/哈濤