HPLC法測(cè)定歸芪補(bǔ)血口服液中黃芪甲苷的含量

摘要：在臨床中，通過(guò)等度洗脫的高效液相色譜法，對(duì)歸芪補(bǔ)血口服液中所含的微量物質(zhì)黃芪甲苷的含量進(jìn)行測(cè)定，在測(cè)試中，經(jīng)過(guò)對(duì)不同的樣品進(jìn)行檢測(cè)和對(duì)比，確立起了最好的提取條件以及檢測(cè)條件。這樣的方法十分的簡(jiǎn)便容易操作，測(cè)量的精密度和準(zhǔn)確度都是十分值得參考的，具有很好的穩(wěn)定性，回收率也比較高，所以能夠作為測(cè)定歸芪補(bǔ)血口服液中黃芪甲苷提供方法的依據(jù)。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；歸芪補(bǔ)血口服液；黃芪甲苷；提取隨著我國(guó)醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展，在我國(guó)很多的常見(jiàn)藥物中，有很多時(shí)具有營(yíng)養(yǎng)機(jī)制和抗氧化價(jià)值的，其藥理活性和藥用價(jià)值都是十分值得研究的，這些藥物在我們的實(shí)際生活中跟人體健康密切相關(guān)。黃芪中富含有很多的黃芪皂苷、黃酮等化合物，這些化合物自身有十分強(qiáng)的生物活性，歸芪補(bǔ)血口服液能夠用在治療細(xì)胞免疫功能低下的慢性肝炎，也可以用于慢性活動(dòng)性肝炎，在臨床中治療的效果十分的有效。不僅如此，歸芪補(bǔ)血口服液還可以用來(lái)治療白細(xì)胞減少癥及和血小板減少性紫癜。在對(duì)蒙古黃芪中的皂苷類(lèi)和黃酮類(lèi)有效成分的相關(guān)的研究和探索中發(fā)現(xiàn)，皂苷類(lèi)成分擁有14個(gè)共有峰，而黃酮類(lèi)成分則具有12個(gè)共有峰[1-3]，這些數(shù)據(jù)說(shuō)明這些成分的化學(xué)成分是十分復(fù)雜的，那么對(duì)有效物質(zhì)的提取和檢測(cè)的要求就會(huì)變的很高。

1材料與儀器

試劑：95％乙醇；無(wú)水乙醇；氯仿；正丁醇；丙酮；無(wú)水乙醚；鹽酸；碳酸鋇；乙酸酐。上述所有的劑都是分析純。儀器：UV-2401P紫外分光光度儀，TG328B光電分析天平；CKQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器。Gilentlloo高效液相色譜儀；HH-S2系列恒溫水浴鍋；FTIR一8400S型紅外光譜儀；GSP-84-02型磁力恒溫?cái)嚢杵?，上述儀器都是由島津公司生產(chǎn)。

2檢測(cè)的方法與取得的結(jié)果

2.1對(duì)黃芪甲苷的提取歸芪補(bǔ)血口服液50ml加入6倍體積量(V／V)的60％乙醇，NaOH飽和溶液調(diào)節(jié)pH至12，溫度：調(diào)節(jié)至60°，通過(guò)加熱回流提取2次，最終得到提取液200ml，之后通過(guò)減壓濃縮獲取到濃縮液約100ml。通過(guò)重復(fù)的濃縮液萃取，最終得到黃芪甲苷粗品約25.0mg，通過(guò)HPLC檢測(cè)純度超過(guò)80％。之后再次進(jìn)行反相硅膠C-18常壓色譜柱分離，并通過(guò)60％甲醇洗脫，最終獲得黃芪甲苷純品約13.5mg，在實(shí)際的檢測(cè)中HPLC檢測(cè)純度符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。詳細(xì)的數(shù)據(jù)可以參照具體HPLC圖與主峰含量，附件為圖1與表1。經(jīng)過(guò)掃描的結(jié)果顯示，黃芪甲苷在325nm處顯示出的波長(zhǎng)處吸收最強(qiáng)，這時(shí)其靈敏度較高。將峰面積積分值為縱坐標(biāo)，而將對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，以橫縱坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。得到回歸方程：黃芪甲苷Y=13.614X-1.4897，r=0.9999。線(xiàn)性范圍為10.2-102ug／mL。

圖1黃芪甲苷純品HPLC色譜圖

2.2相關(guān)樣本的準(zhǔn)備工作在檢測(cè)中，把3份樣品放置在20ml的容量瓶中，這三份樣品具有不同的生產(chǎn)日期，并且都經(jīng)過(guò)了抽提，將提取液大約15ml浸泡，在室溫條件下，放置大約4h，放置后通過(guò)超聲提取30min，在進(jìn)行了過(guò)濾后，將得到的濾液于物理蒸干溶劑，對(duì)過(guò)濾的殘?jiān)? mL甲醇一甲酸進(jìn)行溶解，之后放置在固定容量為5ml的容器瓶中，將溫度調(diào)至4°以下進(jìn)行保存，等待檢測(cè)。

2.3測(cè)量的精密度和測(cè)量準(zhǔn)確度提取混合對(duì)照品溶液20 mL，對(duì)樣品溶液進(jìn)行HPLC檢測(cè)，檢測(cè)過(guò)程中連續(xù)進(jìn)樣6次，然后得到黃芪甲苷面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.59％，檢測(cè)結(jié)果顯示出該方法測(cè)量的精度十分準(zhǔn)確。從已知精密度的黃芪甲苷樣品中，取三份樣品，通過(guò)樣品來(lái)準(zhǔn)備跟處理方法制備計(jì)算回收率，經(jīng)過(guò)計(jì)算得知結(jié)果分別為95.9％、94.5％和95.0％，通過(guò)這組數(shù)據(jù)可以得知，這樣的測(cè)量收率高。

2.4進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)將3份樣品通過(guò)制備方法制備溶液后，然后進(jìn)行0h，1d，2d，3d時(shí)的進(jìn)樣測(cè)定，通過(guò)檢測(cè)得到的結(jié)果顯示，3份樣品溶液在3d范圍內(nèi)，都能保證性質(zhì)的基本穩(wěn)定。

2.5對(duì)含量的測(cè)定分別通過(guò)精密的儀器西區(qū)3份黃芪甲苷樣品的提取液20mL，然后進(jìn)樣，對(duì)測(cè)定的結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄。

3討論

本研究所測(cè)定的黃芪甲苷屬于黃芪制劑當(dāng)中的一種主要的活性成，它在臨床上已經(jīng)得到證實(shí)，具有抗炎降壓的功效，也有鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜的功能。近年來(lái)，許多學(xué)者通過(guò)現(xiàn)代藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷一方面可以改善及優(yōu)化白細(xì)胞的變形能力，另一方面可以改善提高心肌收縮與舒張的功能，也可以提升胰島素在機(jī)體中的分泌能力，及清除機(jī)體自由基等。目前黃芪制劑中黃芪甲苷含量測(cè)定方法有比色法、TLCS法、HPLC法等[4-8]。

比色法利用了黃芪甲苷跟顯色劑可以發(fā)生特殊的顯色反應(yīng)從而生成某類(lèi)有色的物質(zhì)，使它可以運(yùn)用可見(jiàn)分光光度儀來(lái)測(cè)定。一般常見(jiàn)的顯色劑為香草醛--硫酸與香草醛-高氯酸等。常常是使用香草醛-硫酸比色法對(duì)黃芪甲苷進(jìn)行測(cè)定。這種方法主要是采用在濃H2SO4這種介質(zhì)中，使黃芪甲苷的酚羥基跟香草醛醛基實(shí)發(fā)生醛縮合的反應(yīng)。把需要測(cè)定的樣品通過(guò)乙醇給予溶解以后，然后加入適量的香草醛液及硫酸液，一般對(duì)其加熱約 15min，接著放在 578nm處進(jìn)行吸收度的測(cè)定。此方法可以說(shuō)操作比較簡(jiǎn)便，發(fā)生反應(yīng)的靈敏度也比較高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性比較好。

TLCS法(薄層掃描法)又稱(chēng)原位定量薄層色譜掃描法（QTLC）系指用一定的波長(zhǎng)的光照射在薄層板上，對(duì)薄層色譜中有紫外或可見(jiàn)吸收的斑點(diǎn)或經(jīng)照射能激發(fā)產(chǎn)生熒光斑點(diǎn)進(jìn)行掃描，將掃描得到的圖譜及積分值用于藥品定性定量的分析方法。這種方法大部分是運(yùn)用雙波長(zhǎng)掃描的方法，以消除其中的有機(jī)成分之干擾與操作誤差，進(jìn)而提高靈敏度與準(zhǔn)確度，可分為內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法。齊瑗晶等測(cè)定了催乳顆粒劑中黃芪甲苷的含量。實(shí)驗(yàn)中樣品用氫氧化鉀液提取除去酸性成分，以正丁醇萃取使背景干擾少，用大孔樹(shù)脂分離皂苷除去樣品中糖類(lèi)等水溶性雜質(zhì)，并在層析缸中放一小杯氨水，使斑點(diǎn)分離明顯；加樣回收率為97.39%。此方法使用不簡(jiǎn)便、干擾因素多、準(zhǔn)確度低、重復(fù)性不好。

HPLC法 是以液體作為流動(dòng)相，并采用顆粒極細(xì)的高效固定相的柱色譜分離技術(shù)。

因其分離度好、靈敏性高，適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于黃芪甲苷的含量測(cè)定、穩(wěn)定性、藥理和臨床研究中。高效液相色譜法應(yīng)用于藥物含量的測(cè)定在藥物分析中是主要的一個(gè)方面，是一種集分離和測(cè)定為一體的分析方法，主要的特點(diǎn)是：專(zhuān)一性強(qiáng)，靈敏，快速簡(jiǎn)便。

由此可見(jiàn)，對(duì)黃芪甲苷的分析方法中，大部分制劑因?yàn)槌煞直容^復(fù)雜，容易受到外界的干擾，而HPLC 法與 TLCS 法則操作比較簡(jiǎn)單、可以快速、高效地測(cè)定出結(jié)果，因此這2種方法是比較好的選擇[9-14]。

綜上所述，在當(dāng)前的醫(yī)學(xué)發(fā)展中，黃芪甲苷的測(cè)定方法主要有傳統(tǒng)的薄層色譜法(TLC)、毛細(xì)管電泳法(CZE)等，然而這些傳統(tǒng)的方法在世界的測(cè)定中，都沒(méi)有很好的靈敏度以及重復(fù)性。通過(guò)這樣的實(shí)驗(yàn)，建立了測(cè)定歸芪補(bǔ)血口服液中黃芪甲苷的HPLC法，再通過(guò)采用反相硅膠C-18常壓色譜柱分離，使用60％甲醇洗脫，實(shí)驗(yàn)中對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行選擇的時(shí)候，是通過(guò)流動(dòng)相為溶劑稀釋的對(duì)照品來(lái)進(jìn)行的，實(shí)驗(yàn)中采用的紫外分光光度法在200~400的掃描吸收光譜，實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)顯示黃芪甲苷在325 nm處有吸收量和靈敏度都達(dá)到最高峰，所以故選定325 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。而實(shí)驗(yàn)中最佳提取條件為：區(qū)6倍于注射體積的乙醇，保持提取溫度為60°，pH值為12。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，HPLC法供試品溶液制備試驗(yàn)中，用三氯甲烷萃取歸芪補(bǔ)血口服液及用60％甲醇洗脫固體小柱，均能去掉大部分雜峰，使黃苠甲苷有效峰與雜峰能有效的分離。通過(guò)具體的實(shí)驗(yàn)可以得知HPLC法操作簡(jiǎn)便迅速，而實(shí)驗(yàn)的效果和穩(wěn)定性都比較好，這一方法能夠作為歸芪補(bǔ)血口服液中黃芪甲苷物質(zhì)提供方法依據(jù)。

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編輯/哈濤