薄層色譜自顯影法分離檢測(cè)海洋放線菌T-2-3中抑菌成分

摘要：目的采用薄層色譜生物自顯影方法對(duì)北極海洋放線菌T-2-3提取物的抑菌成分進(jìn)行研究。方法采用大孔樹(shù)脂對(duì)該放線菌活性成分進(jìn)行富集，并針對(duì)活性成分進(jìn)行薄層生物自顯影檢測(cè)。結(jié)果經(jīng)檢測(cè)，Rf 0.40的點(diǎn)為活性化合物。結(jié)論薄層色譜生物自顯影法是一種快速分離檢測(cè)抑菌成分的實(shí)驗(yàn)手段。

關(guān)鍵詞：薄層色譜生物自顯影；海洋放線菌；抑菌活性

Detcetion of Antimicrobial Components from the Marine Actinomycetes T-2-3 by TLC Bioautography

MI Hui-wen， LU Yuan-yuan， XING Ying-ying，XI Tao

(Department of Marine Pharmacy， School of Life Science Technology， China Pharmaceutical University， Nanjing 210009，Jiangsu，China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the antimicrobial components in extracts of Arctic Marine actinomycetes T-2-3 by TLC bioautography. MethodsThe active fraction was extracted by macroporous resin， and detected by TLC bioautography. ResultsThe compoud of Rf 0.40 behave antimicrobial activity. ConclusionTLC bioautography is a fast method to isolate and detect antimicrobial activity components.

Key words：TLC bioautography; Marine actinomycetes; Antimicrobial activity海洋微生物由于其特殊的生存環(huán)境，表現(xiàn)出特異的代謝方式，同時(shí)可以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎且具有特殊生物活性的化合物，是海洋生物活性物質(zhì)的重要來(lái)源[1]。目前為止，已知有22000多種微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物中70%由放線菌產(chǎn)生，而10000多種抗生素由鏈霉菌屬產(chǎn)生[2]。鏈霉菌屬在放線菌中占有重要的地位，是生物活性物質(zhì)的重要來(lái)源。

薄層色譜生物自顯影法（TLC-Bioautography）是近年來(lái)應(yīng)用的一種集分離、生物活性和鑒定于一體的\"化合物+生物活性\"的測(cè)定方法[3-4]。本實(shí)驗(yàn)室前期從北極海底海泥沉積物中分離得到一株海洋放線菌T-2-3，經(jīng)初步鑒定為鏈霉菌屬。本實(shí)驗(yàn)利用TLC-生物自顯影法對(duì)T-2-3的提取物中的抗菌活性成分進(jìn)行檢測(cè)，為進(jìn)一步分離純化活性成分提供了依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料 噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自Sigma公司；替加環(huán)素、氨芐西林購(gòu)自美國(guó)Amresco公司。所用試劑均為市售分析純。

1.2方法

1.2.1 T-2-3菌株粗提物樣品制備 將生長(zhǎng)良好的T-2-3斜面培養(yǎng)物接種至種子培養(yǎng)基中，180 r/min搖床，28 ℃培養(yǎng)3 d；然后轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，180 r/min搖床，28℃下持續(xù)發(fā)酵5 d，收取發(fā)酵液，并用D-101大孔樹(shù)脂富集，依次用水，100%乙醇梯度洗脫，洗脫部位減壓濃縮得浸膏，將乙醇梯度的浸膏用甲醇溶解，制備成 20 mg/mL供試樣品。

1.2.2供試菌及其培養(yǎng) 供試細(xì)菌：①革蘭氏陽(yáng)性菌：金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、藤黃八疊球菌；②革蘭氏陰性菌：大腸桿菌、肺炎克雷伯桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌；③臨床耐藥菌：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）3株、耐甲氧西林表皮葡萄球菌3株、肺炎克雷伯桿菌3株、鮑曼不動(dòng)桿菌3株。以上菌株由中國(guó)藥科大學(xué)海洋藥物研究中心提供。

細(xì)菌及臨床耐藥菌的培養(yǎng)：挑取單菌落接到100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，過(guò)夜培養(yǎng)，菌液稀釋至106 CFU/mL，待用。

1.2.3打孔擴(kuò)散法檢測(cè)提取物的抑菌活性 提取物用甲醇溶解配成濃度為2 mg/mL的溶液，作為檢測(cè)樣品。將氨芐西林、替加環(huán)素配成100 μg/mL的溶液，分別為陽(yáng)性對(duì)照。將LB瓊脂（含量為2%）培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，厚度約為4 mm，待其冷卻凝固。然后，取200 μL指示菌種子液用涂布棒均勻涂布，用打孔器（Ф=6 mm）在培養(yǎng)基上打孔，每皿4個(gè)孔，每孔加藥100 μL，分別為空白對(duì)照、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、樣品，37℃下培養(yǎng)18~22 h后，觀察結(jié)果，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.4提取物的薄層層析 將甲醇溶解的提取物采用毛細(xì)管點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量為5 μL，點(diǎn)樣直徑<3 mm。預(yù)先用展開(kāi)劑（氯仿：甲醇=7∶4）飽和層析缸，5 min后將硅膠板放入層析缸，進(jìn)行線性上行展開(kāi)，當(dāng)展開(kāi)劑至硅膠板上端1 cm處，取出并用鉛筆標(biāo)記溶劑前沿，揮干溶劑，然后用5%硫酸-乙醇噴霧，100℃下加熱顯色5 min。

1.2.5生物自顯影 將展開(kāi)的薄層板在超凈工作臺(tái)上紫外殺菌30 min。將含有2%瓊脂的LB培養(yǎng)基，以涂布法涂加指示菌，即先將溫度為40℃~50℃的LB瓊脂培養(yǎng)基涂加到薄層板上，待培養(yǎng)基凝固后，在薄層板上涂加200 μL的指示菌種子液，將薄層板放在濕室內(nèi)37 ℃培養(yǎng)12 h，取出薄層板，在上面噴加外源顯色劑噻唑藍(lán)（MTT），約10 min后，即可觀察結(jié)果。有抑菌成分處，指示菌由于受到抑菌成分的抑制而出現(xiàn)抑菌斑；無(wú)抑菌成分處，指示菌正常生長(zhǎng)，通過(guò)MTT顯色出現(xiàn)藍(lán)色背景色，與抑菌斑區(qū)分開(kāi)[5]。

2結(jié)果與分析

2.1打孔擴(kuò)散法對(duì)抑菌成分的檢測(cè) 提取物對(duì)多種G+、G-細(xì)菌及多種臨床耐藥菌有明顯的抑制活性，見(jiàn)表1、表2，其中對(duì)G+的抑制活性明顯強(qiáng)于G-及多種臨床耐藥菌。

2.1.1提取物對(duì)細(xì)菌的抑制活性，見(jiàn)表1，抑制圈表示為（x±s）。

2.1.2提取物對(duì)臨床耐藥菌的抑制活性，見(jiàn)表2。

2.2 TLC-生物自顯影法對(duì)抑菌成分的檢測(cè) 采用TLC-生物自顯影法初步檢測(cè)了樣品對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及MRSA的抑制活性，見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，薄層板上有兩個(gè)明顯的點(diǎn)J1、J2，Rf值分別為0.67、0.40，其中J2顯示為活性點(diǎn)，對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及MRSA分別有不同程度的抑制活性。

圖1 TLC-生物自顯影檢測(cè)放線菌T-2-3提取物中抑菌活性成分

注：A：5%硫酸-乙醇加熱顯色；B、C、D分別為樣品對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、MRSA的抑菌效果。

3討論

海洋特殊生態(tài)環(huán)境中的生命資源已成為拓展天然藥用資源的新空間，也是目前資源最豐富、保存最完整、最具新藥開(kāi)發(fā)潛力的新領(lǐng)域[6]。TLC-生物自顯影法可在普通實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果直觀，重復(fù)性好，靈敏度高，已廣泛用于多種生物活性物質(zhì)如抗菌劑、酶抑制劑、抗氧化劑的篩選。本文在TLC-生物自顯影的基礎(chǔ)上結(jié)合MTT比色法，檢測(cè)了北極海洋放線菌T-2-3提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及MRSA的抑菌成分，并根據(jù)活性成分的極性大小，為活性成分的進(jìn)一步分離純化提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

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編輯/肖慧