奧美拉唑促進K562細胞凋亡作用的研究

摘要：目的初步探討奧美拉唑促進人白血病細胞系K562細胞凋亡的作用其作用機制。方法采用四唑藍（MTT）比色法觀察奧美拉唑?qū)562細胞的毒性作用，計算IC50、IC20值；臺盼蘭試驗測定在不同pH環(huán)境下奧美拉唑?qū)562細胞生長影響；Annexin V法檢測奧美拉唑處理后細胞凋亡變化。結果奧美拉唑?qū)562細胞的IC50值為127.031 μg/mL，IC20為59.315 μg/mL；奧美拉唑處理的細胞均出現(xiàn)藍染細胞，且隨著pH值的降低藍染細胞增多；奧美拉唑處理K562細胞24 h、48 h與空白對照值比較凋亡百分比明顯增加(P<0.05)；24 h、48 h同等劑量之間凋亡百分比比較也有差異(P<0.05)； Caspase家族抑制劑與奧美拉唑共處理K562細胞24 h與奧美拉唑單獨處理24 h后的凋亡百分比比較無明顯差異(P>0.05)。結論在含有一定濃度的奧美拉唑的酸性環(huán)境中K562細胞生存率大大降低；一定濃度的奧美拉唑能夠促進K562細胞凋亡，呈劑量時間依賴性；奧美拉唑促K562細胞凋亡是非Caspases途徑。

關鍵詞：奧美拉唑；K562細胞；細胞凋亡早在1965年，Warbury提出腫瘤細胞能夠進行很強的無氧酵解獲得能量，產(chǎn)生大量H+和乳酸[1]。惡性實體腫瘤組織內(nèi)微環(huán)境不同程度的存在著的低pH、低O2，其將導致腫微環(huán)境酸化。缺氧和細胞外微環(huán)境酸化不利于腫瘤細胞凋亡，降低了腫瘤的化療效果。質(zhì)子泵抑制劑如奧美拉唑是標準治療酸相關疾病的藥物，其需要一個酸性環(huán)境才能發(fā)揮活性[2]，而腫瘤細胞微環(huán)境酸化為質(zhì)子泵抑制劑發(fā)揮作用提供有利場所。因此，我們推測通過質(zhì)子泵抑制劑逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的異常酸環(huán)境，破壞腫瘤細胞重要的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定機制，從而導致細胞死亡。

1資料與方法

1.1一般資料 RPMI1640購于美國Gibco公司；奧美拉唑購于阿斯利康制藥有限公司，Z-VAD-FMK購于瑞士Alexis公司，0.4%臺盼蘭購于美國Invitrogen公司，MTT購于上海華舜生物工程有限公司，Annexin V檢測試劑盒購于美國BD公司，人白血病細胞K562購自中國科學院上海細胞研究所。

1.2 MTT法測定奧美拉唑?qū)562的細胞毒作用 將對數(shù)生長期K562細胞制成單細胞懸液，接種于24孔板上（每孔1 mL）。每孔加入奧美拉唑（終濃度為40、80、120、200、300 μg/mL），再依次接入96孔板，每個濃度級設3個復孔，培養(yǎng)48 h后每孔加MTT(5 mg/L) 20 μL，繼續(xù)孵育4 h，后每孔加DMSO 100 μL，在490 nm波長的酶聯(lián)免疫測定儀上檢測吸光度(A)值，實驗重復3次，取3次的平均值，計算奧美拉唑?qū)562的IC50、IC20值。

1.3臺盼蘭試驗測定在不同pH下奧美拉唑?qū)562細胞生長影響：將對數(shù)生長期K562細胞分別接種在pH為7.0、6.5、6.0、5.5、5.0的細胞培養(yǎng)液中，至24孔板上（每孔1 mL）。實驗分為兩部分：①細胞不予任何處理，②細胞加入終濃度為50 μg/mL的奧美拉唑，培養(yǎng)24 h后收集細胞，加入0.4%臺盼蘭，5 min后計數(shù)記錄藍染及未染色細胞數(shù)目，實驗重復3次。

1.4流式細胞儀檢測奧美拉唑處理后細胞凋亡 K562細胞制成單細胞懸液，接種于6孔板上(2 mL/孔)。每孔中加入奧美拉唑（終濃度分別為180、240、300、400 μg/mL），每個濃度級設3個復孔。培養(yǎng)24 h后收集部分細胞（其余細胞培養(yǎng)48 h時收集），用4.0℃預冷的PBS洗滌2次，用1×blot Buffer重懸細胞。各加入Annexin V 10 μL，PI 20 μL，另設空白對照，F(xiàn)ITC對照(只加入Annexin V 10 μL)，PI對照(只加入PI 20 μL)，常溫避光孵育15 min。洗滌細胞后上流式細胞儀檢測凋亡細胞。

1.5 Caspase家族抑制劑對K562細胞凋亡影響 將對數(shù)生長期K562細胞制成單細胞懸液，接種于6孔板上（2 mL/孔）。每孔中加入Z-VAD-FMK 2 μL，并加入奧美拉唑（終濃度分別為180、240、300、400μg/ml），每個濃度級設3個復孔。培養(yǎng)24 h后收集細胞，用4.0℃預冷的PBS洗滌2次，用1×blot Buffer重懸細胞。各加入Annexin V 10 μL，PI 20 μL，另設空白對照，F(xiàn)ITC對照(只加入Annexin V μL)，PI對照(只加入PI 20 μL)，常溫避光孵育15 min。洗滌細胞后檢測凋亡細胞。

1.6統(tǒng)計學處理 用SPSS 11.5軟件進行統(tǒng)計分析，結果以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用方差分析和兩組資料比較的t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1奧美拉唑?qū)562的細胞毒作用 奧美拉唑?qū)562細胞的IC50值為（127.031±0.031）μg/mL，IC20為（59.315±0.063） μg/mL。選取無細胞毒性作用的50 μg/mL奧美拉唑濃度進行后續(xù)實驗。

2.2不同pH環(huán)境下奧美拉唑?qū)562細胞生長影響 在不同pH值的細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)K562細胞24 h后采用臺盼蘭試驗測定細胞活力，幾乎未見藍染細胞；而加入奧美拉唑的細胞組出現(xiàn)不同程度的藍染細胞，且隨著pH的降低藍染細胞增多。

2.3奧美拉唑處理后細胞凋亡情況 空白對照K562細胞凋亡百分比為(0.757±0.006)%，奧美拉唑（終濃度分別為180、240、300、400 μg/mL）處理K562細胞24 h凋亡百分比依次為(18.960±0.282)%、(49.367±1.233)%、(75.510±0.958)%、(90.657±0.398)% (n=3)；與空白對照值比較凋亡百分比明顯增加(P<0.05)。48 h凋亡百分比依次為(28.073±0.445)%、(60.773±0.545)%、(83.257±0.635)%、(93.997±0.095)% (n=3)；與空白對照值比較凋亡百分比明顯增加(P<0.05)，且與同等劑量24 h的凋亡百分比比較也有差異(P<0.05)。見表1。

2.4 Caspase家族抑制劑對K562細胞凋亡影響 Z-VAD-FMK 2 μL與奧美拉唑（終濃度分別為180、240、300、400 μg/mL）共處理K562細胞24 h，凋亡百分比依次為(18.843±0.075)%、(48.233±0.150)%、(74.073±0.825)%、(90.777±0.188)% (n=3)；與未加Caspase家族抑制劑的同等劑量奧美拉唑處理24 h后的凋亡百分比比較無明顯差異(P>0.05)，見表1。

3討論

近10年來，人們研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤細胞是通過破壞正常細胞維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的相關功能而逐漸演變來的。這些功能與控制細胞增殖、侵犯能力、抵抗抗腫瘤劑有關。實際上，在正常組織的細胞外pH是中性的，腫瘤細胞的間質(zhì)是酸性的，由于這個特點，腫瘤細胞具有兩個pH梯度特征：細胞溶質(zhì)與細胞外基質(zhì)存在一個pH梯度，細胞溶質(zhì)與細胞內(nèi)空腔小囊泡存在一個pH梯度。為了避免在這種特征性的環(huán)境中腫瘤細胞內(nèi)酸化，腫瘤細胞有著增強的pH調(diào)節(jié)功能，其泌酸活性增強，細胞內(nèi)pH與正常細胞無明顯差異，使得腫瘤細胞逃避凋亡。

細胞凋亡[3]是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡，1972年由Kerr教授首先提出的。細胞凋亡途徑大家公認的是Caspases途徑。然而，近兩年國內(nèi)外很多學者研究發(fā)現(xiàn)細胞凋亡還存在著非Caspases依賴途徑。例如：東京大學腫瘤細胞研究所研究員也研究[4]提出綠茶的一種成分兒茶素也是通過非Caspases依賴途徑誘導人類慢性髓細胞白血病細胞K562凋亡。

Marie Yeo等人體外實驗發(fā)現(xiàn)[5]在含質(zhì)子泵抑制劑的酸性環(huán)境中胃癌細胞株生存率大大降低，質(zhì)子泵抑制劑可以選擇性的使胃癌細胞凋亡，呈時間劑量依賴性。而正常胃粘膜上皮細胞在上述環(huán)境中可產(chǎn)生HSP70，HSP27抵抗凋亡，達到細胞保護作用。本實驗中，我們觀察了不同pH的培養(yǎng)基中加入無細胞毒性劑量的奧美拉唑作用K562細胞，發(fā)現(xiàn)隨著pH的降低，死亡細胞增多。而未用奧美拉唑處理過的K562細胞能在酸性環(huán)境中存活。說明在含有奧美拉唑的酸性環(huán)境中K562細胞生存率大大降低。后續(xù)實驗表明一定濃度的奧美拉唑能夠促進K562細胞凋亡，且隨著奧美拉唑濃度的增加K562細胞凋亡率增高。48 h與24 h的同濃度級比較隨著時間的延長K562細胞的凋亡也增高。結果表明奧美拉唑能夠促進K562細胞凋亡，呈劑量時間依賴性。對于奧美拉唑促進K562細胞凋亡的途徑，我們作了初步的檢測：在奧美拉唑處理K562細胞的同時，加入Caspases家族抑制劑Z-VAD-FMK共同培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)加入Caspases家族抑制劑后，奧美拉唑促K562細胞凋亡并無減弱。結果提示奧美拉唑促進K562細胞的凋亡作用并非通過Caspases途徑，可能存在著其他的途徑誘導凋亡。

綜上所述，作為臨床治療胃酸疾病的一線藥物質(zhì)子泵抑制劑奧美拉唑，能夠抑制質(zhì)子泵的泌酸功能。在腫瘤細胞株中我們發(fā)現(xiàn)一定濃度的奧美拉唑能夠促K562腫瘤細胞凋亡，且為時間劑量依賴性。而凋亡途徑初步研究是非Caspases途徑。本實驗中我們只是對奧美拉唑抗白血病K562細胞株做了初步的研究，在今后的工作中，我們將繼續(xù)更深入的探討奧美拉唑其促進K562細胞凋亡的機制是什么。如果能獲得突破，將為臨床提高白血病療效提供理論依據(jù)及方案，大大的提高白血病治療的有效率。

參考文獻：

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[5]Yeo M，Kim D，Kim Y，et al．Selective Induction of Apoptosis with Proton Pump Inhibitor in Gastric Cancer Cells[J].Clinical Cancer Research，2004，10:8687-8696．編輯/肖慧