薄層色譜自顯影法分離檢測海洋放線菌T-2-3中抑菌成分

摘要：目的采用薄層色譜生物自顯影方法對北極海洋放線菌T-2-3提取物的抑菌成分進行研究。方法采用大孔樹脂對該放線菌活性成分進行富集，并針對活性成分進行薄層生物自顯影檢測。結(jié)果經(jīng)檢測，Rf 0.40的點為活性化合物。結(jié)論薄層色譜生物自顯影法是一種快速分離檢測抑菌成分的實驗手段。

關(guān)鍵詞：薄層色譜生物自顯影；海洋放線菌；抑菌活性

Detcetion of Antimicrobial Components from the Marine Actinomycetes T-2-3 by TLC Bioautography

MI Hui-wen， LU Yuan-yuan， XING Ying-ying，XI Tao

(Department of Marine Pharmacy， School of Life Science Technology， China Pharmaceutical University， Nanjing 210009，Jiangsu，China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the antimicrobial components in extracts of Arctic Marine actinomycetes T-2-3 by TLC bioautography. MethodsThe active fraction was extracted by macroporous resin， and detected by TLC bioautography. ResultsThe compoud of Rf 0.40 behave antimicrobial activity. ConclusionTLC bioautography is a fast method to isolate and detect antimicrobial activity components.

Key words：TLC bioautography; Marine actinomycetes; Antimicrobial activity海洋微生物由于其特殊的生存環(huán)境，表現(xiàn)出特異的代謝方式，同時可以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎且具有特殊生物活性的化合物，是海洋生物活性物質(zhì)的重要來源[1]。目前為止，已知有22000多種微生物次級代謝產(chǎn)物中70%由放線菌產(chǎn)生，而10000多種抗生素由鏈霉菌屬產(chǎn)生[2]。鏈霉菌屬在放線菌中占有重要的地位，是生物活性物質(zhì)的重要來源。

薄層色譜生物自顯影法（TLC-Bioautography）是近年來應用的一種集分離、生物活性和鑒定于一體的\"化合物+生物活性\"的測定方法[3-4]。本實驗室前期從北極海底海泥沉積物中分離得到一株海洋放線菌T-2-3，經(jīng)初步鑒定為鏈霉菌屬。本實驗利用TLC-生物自顯影法對T-2-3的提取物中的抗菌活性成分進行檢測，為進一步分離純化活性成分提供了依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料 噻唑藍(MTT)購自Sigma公司；替加環(huán)素、氨芐西林購自美國Amresco公司。所用試劑均為市售分析純。

1.2方法

1.2.1 T-2-3菌株粗提物樣品制備 將生長良好的T-2-3斜面培養(yǎng)物接種至種子培養(yǎng)基中，180 r/min搖床，28 ℃培養(yǎng)3 d；然后轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，180 r/min搖床，28℃下持續(xù)發(fā)酵5 d，收取發(fā)酵液，并用D-101大孔樹脂富集，依次用水，100%乙醇梯度洗脫，洗脫部位減壓濃縮得浸膏，將乙醇梯度的浸膏用甲醇溶解，制備成 20 mg/mL供試樣品。

1.2.2供試菌及其培養(yǎng) 供試細菌：①革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、藤黃八疊球菌；②革蘭氏陰性菌：大腸桿菌、肺炎克雷伯桿菌、鮑曼不動桿菌；③臨床耐藥菌：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）3株、耐甲氧西林表皮葡萄球菌3株、肺炎克雷伯桿菌3株、鮑曼不動桿菌3株。以上菌株由中國藥科大學海洋藥物研究中心提供。

細菌及臨床耐藥菌的培養(yǎng)：挑取單菌落接到100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，過夜培養(yǎng)，菌液稀釋至106 CFU/mL，待用。

1.2.3打孔擴散法檢測提取物的抑菌活性 提取物用甲醇溶解配成濃度為2 mg/mL的溶液，作為檢測樣品。將氨芐西林、替加環(huán)素配成100 μg/mL的溶液，分別為陽性對照。將LB瓊脂（含量為2%）培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，厚度約為4 mm，待其冷卻凝固。然后，取200 μL指示菌種子液用涂布棒均勻涂布，用打孔器（Ф=6 mm）在培養(yǎng)基上打孔，每皿4個孔，每孔加藥100 μL，分別為空白對照、陰性對照、陽性對照、樣品，37℃下培養(yǎng)18~22 h后，觀察結(jié)果，測量抑菌圈直徑。

1.2.4提取物的薄層層析 將甲醇溶解的提取物采用毛細管點樣，點樣量為5 μL，點樣直徑<3 mm。預先用展開劑（氯仿：甲醇=7∶4）飽和層析缸，5 min后將硅膠板放入層析缸，進行線性上行展開，當展開劑至硅膠板上端1 cm處，取出并用鉛筆標記溶劑前沿，揮干溶劑，然后用5%硫酸-乙醇噴霧，100℃下加熱顯色5 min。

1.2.5生物自顯影 將展開的薄層板在超凈工作臺上紫外殺菌30 min。將含有2%瓊脂的LB培養(yǎng)基，以涂布法涂加指示菌，即先將溫度為40℃~50℃的LB瓊脂培養(yǎng)基涂加到薄層板上，待培養(yǎng)基凝固后，在薄層板上涂加200 μL的指示菌種子液，將薄層板放在濕室內(nèi)37 ℃培養(yǎng)12 h，取出薄層板，在上面噴加外源顯色劑噻唑藍（MTT），約10 min后，即可觀察結(jié)果。有抑菌成分處，指示菌由于受到抑菌成分的抑制而出現(xiàn)抑菌斑；無抑菌成分處，指示菌正常生長，通過MTT顯色出現(xiàn)藍色背景色，與抑菌斑區(qū)分開[5]。

2結(jié)果與分析

2.1打孔擴散法對抑菌成分的檢測 提取物對多種G+、G-細菌及多種臨床耐藥菌有明顯的抑制活性，見表1、表2，其中對G+的抑制活性明顯強于G-及多種臨床耐藥菌。

2.1.1提取物對細菌的抑制活性，見表1，抑制圈表示為（x±s）。

2.1.2提取物對臨床耐藥菌的抑制活性，見表2。

2.2 TLC-生物自顯影法對抑菌成分的檢測 采用TLC-生物自顯影法初步檢測了樣品對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及MRSA的抑制活性，見圖1。結(jié)果顯示，薄層板上有兩個明顯的點J1、J2，Rf值分別為0.67、0.40，其中J2顯示為活性點，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及MRSA分別有不同程度的抑制活性。

圖1 TLC-生物自顯影檢測放線菌T-2-3提取物中抑菌活性成分

注：A：5%硫酸-乙醇加熱顯色；B、C、D分別為樣品對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、MRSA的抑菌效果。

3討論

海洋特殊生態(tài)環(huán)境中的生命資源已成為拓展天然藥用資源的新空間，也是目前資源最豐富、保存最完整、最具新藥開發(fā)潛力的新領域[6]。TLC-生物自顯影法可在普通實驗室條件下進行，操作簡單，結(jié)果直觀，重復性好，靈敏度高，已廣泛用于多種生物活性物質(zhì)如抗菌劑、酶抑制劑、抗氧化劑的篩選。本文在TLC-生物自顯影的基礎上結(jié)合MTT比色法，檢測了北極海洋放線菌T-2-3提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及MRSA的抑菌成分，并根據(jù)活性成分的極性大小，為活性成分的進一步分離純化提供依據(jù)。

參考文獻：

[1]黃永中，羅雄明，王建華.海洋沉積物來源鏈霉菌屬次生代謝產(chǎn)物及其生物活性研究進展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，Nat Prod Res Dev，2011，23:758-766.

[2]Fenical，W，Jensen，PR. Developing a new resource for drug discovery: marine actinomycete bacteria[J].Nat. Chem. Biol 2006，2:666-673.

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[4]楊成，熊延靖，劉輝.薄層色譜-自顯影技術(shù)分離檢測石榴皮清除自由基活性成分[J].皖南醫(yī)學院學報，2011，30(4):270-272.

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[6]史清文，李力更，王于方.海洋天然產(chǎn)物研究與新藥開發(fā)[J].藥物評價研究，2011，3(33):165-174.

編輯/肖慧