甲醛復(fù)制小鼠輸卵管炎性不孕癥動物模型的研究

摘要：目的通過向小鼠輸卵管注入適量甲醛，復(fù)制炎性不孕動物模型。方法成熟雌性KM小鼠隨機分對照組、細菌感染組、高劑量甲醛組、中劑量甲醛組和低劑量甲醛組(每組15只)，分別向輸卵管內(nèi)注入生理鹽水、混合菌液、3%甲醛、2%甲醛和1.5%甲醛各0.02 mL(左右各0.01 mL)，10 d后與成熟公鼠3∶1晚20∶00合籠，次日晨8∶00觀察有陰道栓判為受孕，未孕鼠則繼續(xù)合籠，連續(xù)3 d后統(tǒng)計受孕率。每組再隨機取5只小鼠脫臼處死，觀察輸卵管大體解剖并取組織用10%甲醛固定作病理切片H.E.染色觀察。結(jié)果高、中、低劑量甲醛組小鼠受孕率均顯著低于對照組（均P<0.01），而與細菌感染組無顯著差異（均P>0.05）。高、中、低劑量甲醛組和細菌感染組肉眼觀可見輸卵管有不同程度僵硬、積水或積膿，輸卵管與周圍組織有不同程度粘連；切片鏡下觀可見輸卵管腫脹增厚，黏膜皺褶明顯減少，全層可見大量炎細胞浸潤。結(jié)論輸卵管內(nèi)注入適量甲醛可成功復(fù)制小鼠輸卵管炎性不孕動物模型。

關(guān)鍵詞：甲醛；輸卵管炎；不孕癥；動物模型；小鼠

據(jù)資料顯示，由于輸卵管因素所致的不孕占不孕癥的30%～50%，其中非特異性慢性輸卵管炎又占輸卵管因素的50%[1]，可見慢性輸卵管炎是女性不孕癥的重要原因之一。本實驗擬通過向小鼠輸卵管內(nèi)注射適量甲醛溶液，探索復(fù)制輸卵管炎性不孕動物模型，為人類輸卵管炎性不孕的研究提供疾病動物模型?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

1.1.1動物 清潔級成年育齡雌性KM(昆明)種小鼠75只，體重28～32 g，隨機分為生理鹽水組、高劑量甲醛組、中劑量甲醛組、低劑量甲醛組和細菌感染組，每組各15只；成熟雄性小鼠25只，體重32～36 g，均由廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供（實驗動物號SCXK2009-0002）。

1.1.2細菌 菌種由廣西醫(yī)科大學微生物學教研室培養(yǎng)和提供，以大腸埃希菌、金葡菌、鏈球菌按2∶1∶1比例用無菌生理鹽水稀釋，配成濃度約為3×109/mL混合菌。

1.1.3儀器 光學顯微鏡：OlympusCX41奧林巴斯顯微鏡，日本奧林巴斯株式會社生產(chǎn)。

1.2方法 用一次性黃色塑料移液管剪去適量末端自制小鼠\"擴陰器\"以將雌性小鼠的陰道撐開，然后將注射器針頭緩緩插入子宮體腔，分別在兩側(cè)輸卵管的開口處進針，向輸卵管到卵巢方向緩慢注射；為防止注射液返流回子宮腔，注射時小鼠的頭位朝下，陰道口朝上，并且在注入液體稍滯留片刻后再慢慢將針頭拔出，防止液體倒流。高劑量甲醛組、中劑量甲醛組、低劑量甲醛組分別注射用無菌生理鹽水配制的3%、2%、1.5%的甲醛溶液0.02 mL（左右側(cè)輸卵管各注入0.01 mL）；方法同上，細菌感染組則注入現(xiàn)配好的細菌混懸液0.02 mL，生理鹽水組則注入無菌生理鹽水0.02 mL。

1.5合籠配種 造模后第10 d，各組雌鼠與成熟公鼠按3∶1于晚上20∶00關(guān)燈合籠過夜，次日晨8∶00檢查，陰道口有陰道栓者判為已孕，無陰道栓為未孕。未孕雌鼠則繼續(xù)合籠同上，連續(xù)3 d，最后統(tǒng)計各組小鼠受孕率，公式：受孕率=(組內(nèi)受孕鼠數(shù)/組內(nèi)配種雌鼠總數(shù))×100%。

1.6形態(tài)學觀察 配種結(jié)束時，每組隨機抽取5只雌鼠脫臼處死，剖腹觀察輸卵管大體病理學改變，包括輸卵管形狀、色澤改變情況，與周圍組織有無粘連，是否增粗或變細，彈性變化，以及有無積水、化膿等。然后各取小塊組織用10%中性甲醛溶液固定，作常規(guī)病理切片和H.E.染色，光鏡下觀察其形態(tài)學改變。

1.7統(tǒng)計學方法 各組受孕率比較采用χ2檢驗，使用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1小鼠受孕情況 受孕情況，見表1。

2.2一般情況和大體病理 實驗中，高、中、低劑量甲醛組小鼠因嚴重感染分別死亡了2只、3只、1只，皆死于術(shù)后1 w內(nèi)。生理鹽水組小鼠剖腹可見輸卵管外觀粗細均勻、光滑圓潤，色澤紅潤，富有彈性，與周圍組織無粘連，無積水或化膿現(xiàn)象。與生理鹽水組比較，高、中、低劑量甲醛組和細菌組小鼠輸卵管均見到不同程度色澤蒼白，明顯變細，粗糙，彈性差，脆而易損，與周圍組織或多或少有粘連，個別輸卵管及其周圍組織可見積水或積膿。

2.3光鏡觀察病理學改變 常規(guī)切片H.E染色鏡下觀可見生理鹽水組小鼠輸卵管管壁組織結(jié)構(gòu)清晰，管腔通暢，黏膜上皮呈柱狀，有纖毛，見圖1:a，f。高劑量甲醛組、中劑量甲醛組、低劑量甲醛組和細菌感染組小鼠輸卵管管壁結(jié)構(gòu)分界不清晰，管腔變窄甚至阻塞，纖維組織明顯增生，血管擴張充血，全層可見淋巴細胞、漿細胞及少量酸性粒細胞等炎性細胞浸潤，見圖1:b，c，d，e，g，h。

圖1 甲醛處置對小鼠輸卵管內(nèi)膜的影響

3討論

在小鼠，輸卵管是胚胎種植處，任何影響輸卵管生理功能的因素均可能導致不孕。研究表明，人類輸卵管及小鼠輸卵管病理上出現(xiàn)炎癥滲出、積水、積膿、粘連，以及產(chǎn)生纖維疤痕、管壁變硬、增厚，可導致輸卵管或輸卵管狹窄、阻塞，妨礙受精或種植可造成不孕[2-3]。

有關(guān)生殖道炎癥復(fù)制不孕動物模型，國內(nèi)徐桂中[3]等用金黃色葡萄球菌制作小鼠慢性輸卵管性不孕模型；黃河玲[4]等用苯酚膠漿劑注射制作兔子慢性輸卵管炎模型；李祥云[5]等用β溶血性鏈球菌制作兔子輸卵管阻塞模型；劉麗[6]等用混合菌金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、大腸桿菌等制作大鼠輸卵管不孕模型。國外，Pearlman MD等用大腸桿菌制作家兔不孕動物模型[7]，Patton DL等則用衣原體復(fù)制猴的不孕動物模型[8]。但對于小鼠用甲醛損傷輸卵管造成炎癥從而復(fù)制不孕動物模型尚未見有文獻報道。本實驗采用自制\"擴陰器\"在非麻醉狀態(tài)下進行輸卵管甲醛注射，對小鼠創(chuàng)傷小，操作簡便并易于推廣；再者，造成的炎癥效果和細菌制作輸卵管炎癥模型相似，不孕情況相近。故我們認為通過輸卵管注入適量甲醛損傷輸卵管致炎性損傷，是一種簡便易行的不孕動物模型制作方法。

參考文獻：

[1]佟慕光.不孕不育.第一版.上?？茖W技術(shù)出版社，1984:7-8.

[2]李栓，于英奇.男女不孕育診治匯萃[J].北京：中國中醫(yī)藥出版社，1993:89.

[3]徐桂中，張欣，侯一平，等.金黃色葡萄球菌致小鼠慢性輸卵管炎性不孕模型制作[J].中國比較醫(yī)學雜志，2011，21（3）:6-9.

[4]黃河玲，吳高媛.兔慢性輸卵管炎動物模型的建立[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2000，9（20）:1982-1983.

[5]李祥云，胡曉梅，李路，等.\"峻竣煎\"對輸卵管炎變阻塞動物模型影響的實驗研究[J].上海中醫(yī)藥雜志，1997，（10）:41-43.

[6]劉麗，谷娜，張軼群，等.解毒除濕化瘀止痛法對輸卵管炎性阻塞性不孕大鼠模型作用機理的研究[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010，5（2）:117-119.

[7]Pearlman MD，McNeeley SG，F(xiàn)rank TS，et al.Antiendotoxin antibody is protective against tubal damage in an Escherichia coli rabbit salpingitis model[J].Am J Obstet Gynecol，1997，171(6):1588-1593.

[8]Patton DL，Sweney YT，Kuo CC.Demonstration of delayed hypersensitivity in Chlamydia trachomaits salpingitis in monkeys:a pathogenic mechanism of tubal damage[J].J Infect Dis，1994，169(3):680-683.編輯/肖慧