聚己內(nèi)酯/明膠/富血小板血漿電紡纖維膜的制備及其性能

摘要：采用靜電紡絲技術(shù)在聚己內(nèi)酯/明膠（PCL/GE）支架的基礎(chǔ)上制備了聚己內(nèi)酯/明膠/富血小板血漿（PCL/GE/PRP）納米纖維支架，考察了該材料的密度、孔隙率、親水性、降解速率以及其細(xì)胞相容性。結(jié)果表明，PCL/GE/PRP 纖維膜的密度及孔隙率介于PCL和PCL/GE纖維膜之間，直徑集中在100~400 nm，相比于PCL/GE纖維膜，PCL/GE/PRP纖維支架的親水性更好，早期降解速度更快，且更利于大鼠脂肪源干細(xì)胞（adipose tissue-derived stem cells，ADSCs）的生長(zhǎng)、增殖。

關(guān)鍵詞：靜電紡絲；納米纖維支架；細(xì)胞相容性

中圖分類(lèi)號(hào)：TB332文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

靜電紡絲是近年來(lái)興起的一種可制備直徑在納米至微米級(jí)的超細(xì)纖維材料技術(shù)。該法制備的納米纖維具有與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）相似的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和生物學(xué)功能[1]，可作為細(xì)胞生長(zhǎng)的多孔支架，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和增殖。靜電紡絲技術(shù)原料來(lái)源廣泛，其中生物相容性和力學(xué)性能較好、可降解、易加工且成本低廉的合成高分子材料聚己內(nèi)酯（PCL）已得到廣泛運(yùn)用[2]。然而由于PCL表面缺乏細(xì)胞親和位點(diǎn)、親水性能差、降解速度較慢，不利于細(xì)胞在組織支架的粘附[3]，故該材料在運(yùn)用中仍需改進(jìn)。天然材料明膠（Gelatin，GE）亦被廣泛運(yùn)用于組織工程材料領(lǐng)域，它具有較好的親水性，有特異性細(xì)胞黏附位點(diǎn)，但其力學(xué)性能差[4]。若將GE與PCL制成復(fù)合材料不僅能增強(qiáng)細(xì)胞黏附，改善PCL的親水性能和調(diào)節(jié)其降解速度，還令其具有良好的機(jī)械強(qiáng)度。

種子細(xì)胞、支架材料、生物活性因子是組織工程的三要素之一，其中生物活性因子可以提供恰當(dāng)?shù)募?xì)胞刺激信號(hào)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖和分化。近年來(lái)有關(guān)富血小板血漿（Platelet-rich plasma，PRP）的運(yùn)用日益增多[5-6]。PRP是利用自身血液制作的含高濃度血小板的血漿，其血小板在激活后可大量分泌具有促進(jìn)傷口、組織愈合和細(xì)胞再生的多種生長(zhǎng)因子，因而PRP亦稱(chēng)為\"富含生長(zhǎng)因子血漿\"[6-8]。本研究在PCL紡絲過(guò)程中混紡一定濃度的GE，并在此基礎(chǔ)上制備了含PRP的PCL/GE納米復(fù)合纖維材料支架，以大鼠脂肪源干細(xì)胞（ADSCs）作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，考察了復(fù)合纖維膜的結(jié)構(gòu)、降解速率及其生物相容性，為制備理想的組織工程支架材料提供新思路。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備 聚己內(nèi)酯（PCL）：美國(guó)Sigma公司；明膠（GE)：北京索萊寶科技有限公司；α-MEM培養(yǎng)基：美國(guó)Invitrogen公司；胎牛血清：杭州四季青生物工程有限公司；胰酶：美國(guó)Gibco公司；大鼠脂肪干細(xì)胞：南昌大學(xué)一附院泌外研究所提供。

掃描電鏡（SEM）：TESCAN公司VEGA3型；傅立葉紅外光譜儀：美國(guó)BRUKERTENSOR-27；接觸角儀：德國(guó)KROSSDSA100。

1.2電紡纖維膜的制備

1.2.1 PCL電紡纖維膜 常溫下稱(chēng)取0.9 g PCL溶于10 mL的TFE溶劑中，制備9wt% 的PCL電紡液。使用7號(hào)的針頭進(jìn)行電紡，電紡電壓為22 kV，接收距離15 cm，注射泵推進(jìn)速率為3.0 mL/h，溫度為37℃。關(guān)閉高壓，停止注射泵，收集到PCL纖維膜，真空冷凍干燥24 h。

1.2.2 PCL/GE電紡纖維膜 常溫下稱(chēng)取0.36 g PCL和 0.54 g GE分別溶于4 mL的TFE中，混合后加入10 μL乙酸（HAc），再補(bǔ)充2 mL TFE，得到9wt% 的PCL/GE電紡液。電紡方法與前述相同，電紡溫度為50℃。

1.2.3 PCL/GE/PRP電紡纖維膜 預(yù)先同上制備PCL/GE電紡纖維膜，隨后將PRP直接電噴在上述已紡織成功的PCL/GE纖維膜上，然后再電紡一層PCL/GE纖維膜，形成三明治結(jié)構(gòu)的復(fù)合納米纖維膜，真空冷凍干燥備用。

1.3表征測(cè)試

1.3.1纖維膜密度及孔隙率測(cè)試 采用稱(chēng)重法測(cè)量纖維膜密度，具體過(guò)程如下：將20 mL密度瓶充滿(mǎn)去離子水，稱(chēng)量其質(zhì)量m1，將質(zhì)量為m2的電紡纖維膜放入充滿(mǎn)水的密度瓶中，稱(chēng)量其質(zhì)量m3（n=4）。利用下列公式求得纖維膜密度ρ，單位為g/cm3：ρ=m2/（m1+m2-m3），得到纖維膜密度ρ后，再利用下列公式求得纖維膜孔隙率ε：ε= (1-ρ/ρ0）×100%公式中ρ0為電紡液自然凝固后的模塊密度，單位為g/cm3。

1.3.2 SEM形貌 將待測(cè)樣品噴金后在掃描電鏡下觀察其微觀形貌，得到的SEM照片使用Adobe Photoshop軟件對(duì)其中的纖維（n=100）進(jìn)行直徑測(cè)量。量取照片上所有不同位置的纖維計(jì)算每根纖維的平均直徑，然后計(jì)算纖維膜中超細(xì)纖維的平均直徑和直徑分布。

1.3.3 全反射傅里葉紅外光譜分析（ATR-FTIR） 采用傅立葉紅外光譜分析儀對(duì)各電紡纖維膜表面的化學(xué)官能團(tuán)進(jìn)行分析。

1.3.4 靜態(tài)接觸角及吸水性測(cè)定 采用靜態(tài)接觸角測(cè)試機(jī)上測(cè)試各纖維膜表面的親水性。所有測(cè)試均在室溫下進(jìn)行，所用水滴體積0.25 μL。

取纖維膜樣品（2 cm×2 cm，n=3），用分析天平稱(chēng)得初始質(zhì)量m0；在PBS緩沖溶液中浸泡24 h后取出，用濾紙吸去膜表面和邊緣的水分，稱(chēng)重得m1。取每種纖維膜三組數(shù)據(jù)取平均值，作為其吸水率數(shù)據(jù)。吸水率＝(m1-m0)/m0×100%。

1.3.5體外降解性測(cè)試 干燥稱(chēng)重（W0），分別浸入模擬體液（0.01M PBS，pH=7.4）并置于37℃恒溫水箱中（n=3）。隔周換液，分別于1月、2月、3月時(shí)取出，37℃恒溫干燥48 h至恒重（Wn），失重率（W%）公式如下。W%=（W0-Wn）/W0×100%，式中，W0式樣的初始重量，Wn式樣n月后的重量，單位為g。

1.4生物學(xué)特性研究

1.4.1大鼠ADSCs的培養(yǎng) 常規(guī)培養(yǎng)大鼠ADSCs，選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ADSCs 用于實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞濃度調(diào)整為為4×105/mL的單細(xì)胞懸液。

1.4.2體外細(xì)胞相容性檢測(cè) 將輻照消毒后的各纖維膜（面積0.8 cm×0.8 cm）分別置于24孔板中，每組3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)基浸泡后，接種大鼠ADSCs單細(xì)胞懸液于24孔板內(nèi)，置5% CO2、37℃的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日半量換液。分別于接種1、3、5、7 d后固定細(xì)胞，DAPI染色、倒置熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)纖維膜上細(xì)胞。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件、單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)運(yùn)算。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果與討論

2.1表征測(cè)試

2.1.1纖維膜密度及孔隙率測(cè)試 PCL、PCL/GE和PCL/GE/PRP纖維膜密度分別為：（0.122±0.003）g/cm3、（0.844±0.085）g/cm3、（0.371±0.012）g/cm3，孔隙率分別為：（0.874±0.003）%、（0.158±0.085）%、（0.681±0.009）%。兩指標(biāo)組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖2，P＜0.01?？梢?jiàn)GE的引入不僅可以提高纖維膜密度，且能改變?cè)兄Ъ艿目紫堵?。在PCL/GE纖維膜的基礎(chǔ)上引入PRP后，纖維膜的密度及孔隙率較PCL和PCL/GE纖維膜有不同程度改變，位于二者之間。

2.1.2 SEM形貌 PCL、PCL/GE、PCL/GE/PRP纖維膜的掃描電鏡圖，見(jiàn)圖1。所示，直徑分別為（323±138）nm、（282±109）nm、（288±149）nm。圖像分析結(jié)果表明，膜纖維直徑分布范圍主要集中在100~400 nm，屬納米級(jí)纖維，該三維立體孔隙構(gòu)架可為細(xì)胞生長(zhǎng)爬行提供有效空間。

圖1 各纖維膜掃描電鏡圖

2.1.3 ATR-FTIR圖譜形貌 a譜中1700~1760 cm-1處存在一個(gè)強(qiáng)吸收峰，此峰為C=O伸縮振動(dòng)峰，是PCL的特征吸收峰；b譜中，1700~1760 cm-1處是PCL的特征峰，GE分子有大量的氨基存在，在1640~1650 cm-1和1500~1560 cm-1 處有強(qiáng)的吸收峰，此為GE中的氮?dú)滏I（N-H）變形振動(dòng)吸收峰。PCL和GE的特征峰出現(xiàn)，表明采用三氟乙醇為溶劑，可以較好混紡PCL/GE纖維；由于ATR-FTIR只能表征出材料表面的化學(xué)官能團(tuán)，鑒于PRP中的各種生長(zhǎng)因子含有大量的氨基，而PCL/GE和PCL/GE/PRP支架在1640~1650 cm-1和1500~1560 cm-1處峰（即N-H變形振動(dòng)峰）面積相當(dāng)(b和c譜)，可見(jiàn)PRP的引入并未影響到材料表面化學(xué)基團(tuán)的檢測(cè)，說(shuō)明本研究采用電噴法將PRP夾在PCL/GE薄膜中間的方法可以將生物活性因子成功包被，見(jiàn)圖2。

圖2 各纖維膜ATR-FTIR圖譜

注：a：PCL纖維膜 b：PCL/GE纖維膜 c：PCL/GE/PRP纖維膜。

2.1.4靜態(tài)接觸角及吸水率檢測(cè) 水滴接觸角的測(cè)定用于評(píng)估材料的親水性，接觸角越小，表明材料表面親水性越強(qiáng)。在室溫下，水滴PCL纖維膜上的接觸角為109°，混紡后，PCL/GE纖維膜、PCL/GE/PRP纖維膜接觸角減小至0°?？梢?jiàn)PCL的親水性差。由于GE分子鏈上帶有大量的氨基以及羧基等親水性基團(tuán)，故GE混紡在PCL纖維膜后可使纖維的親水性能顯著增加，見(jiàn)圖3A。

PCL、PCL/GE和PCL/GE/PRP纖維膜在相同環(huán)境中吸水率分別為（0.219±0.013）、（3.331±0.050）、（3.082±0.094），見(jiàn)圖3B，各纖維膜親水率兩兩比較均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（*P＜0.05，**P＜0.01）。吸水性實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明GE的引入顯著提高了PCL膜的親水性。采用夾心法將PRP引入PCL/GE纖維膜內(nèi)部后制得的PCL/GE/PRP支架的吸水率明顯高于PCL/GE纖維膜，表明引入PRP更有利于提高材料親水性。

圖3 各纖維膜的接觸角及吸水率分析（*P＜0.05，**P＜0.01）

2.1.5體外降解性測(cè)試 各纖維膜在不同時(shí)間點(diǎn)的體外失重率變化。從表中可以看出在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)PCL/GE/PRP纖維膜與PCL/GE纖維膜的失重率均明顯大于PCL纖維膜（*P＜0.05，**P＜0.01），說(shuō)明GE的引入可以促進(jìn)復(fù)合膜中PCL膜的降解。第30 d，PCL/GE/PRP纖維膜的失重率顯著高于PCL/GE纖維膜（#P＜0.05），而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，二者的失重率趨于接近，表明PRP可在早期加速PCL膜的降解，見(jiàn)表1。

2.2體外細(xì)胞相容性檢測(cè) PCL/GE/PRP組與PCL/GE組細(xì)胞數(shù)目在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于PCL組，說(shuō)明GE的引入有利于細(xì)胞的增殖，見(jiàn)圖4。第1 d PCL/GE/PRP組與PCL/GE組的細(xì)胞數(shù)目大致相等，從第3 d開(kāi)始，PCL/GE/PRP組的細(xì)胞數(shù)目明顯高于PCL/GE組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P＜0.05，**P＜0.01，##P＜0.01），表明PRP在早期階段即可促進(jìn)大鼠ADSCs的增殖。

圖4 各纖維膜上大鼠ADSCs生長(zhǎng)情況（×50 μm）

3結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)表明，PCL/GE/PRP納米纖維膜的密度、孔隙率、外觀及直徑與PCL和PCL/GE纖維膜有一定差異，其各項(xiàng)參數(shù)均符合生物工程支架的基本性能要求。就親水性能、降解時(shí)間及細(xì)胞相容性而言，PCL/GE/PRP和PCL/GE纖維膜更適用于組織工程皮膚支架，且PCL/GE/PRP纖維支架的親水性更好，早期降解速度更快，且更利于細(xì)胞的生長(zhǎng)。

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編輯/張燕