板藍根美拉德反應(yīng)對MDCK細胞保護作用的研究

摘要：目的 通過不同處理的板藍根樣品對MDCK細胞的保護作用來分析板藍根加工處理過程中美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（MRPs）的抗病毒作用。方法 將不同加工處理的板藍根樣品加于MDCK細胞，然后接種病毒液，72h后用MTT法于570 nm處測定OD值，并計算保護率。結(jié)果 7th樣品對MDCK細胞受流感病毒侵染有顯著的保護作用，而鮮根、生藥、2nd對流感病毒侵染無明顯阻斷作用，且其在一定濃度范圍內(nèi)對細胞表現(xiàn)出毒害作用。結(jié)論 板藍根樣品對病毒是否有阻斷作用，一方面可能取決于樣品加工過程中產(chǎn)生MRPs的量和種類，另一方面可能與板藍根樣品的加工處理方式相關(guān)。

關(guān)鍵詞：板藍根；美拉德反應(yīng)；抗病毒

Study on Protection of MDCK Cells with Different Ways of Processing of Radix Isatidis extract

WANG Ke-jing1，2，HAN Jian1

(1.Pathogen Biology Research Institute，Basic Medical College of Lanzhou University，Lanzhou 730000，Gansu，China;2.Department of Endocrinology，General Hospital of Lanzhou Military Area Command，Lanzhou 730000，Gansu，China)

Abstract：ObjectiveInvestigate the antiviral effect of Different Radix Isatidis samples to the protection for MDCK cells， study the pharmacological effects of MRPs in the process of Radix Isatidis. MethodsAdd the different Radix Isatidis samples in MDCK cells， and then vaccination disease venom， Measuring the OD value by MTT method at 570 nm after 72 h， and calculate the recovery. Results 7th samples has significant protection on MDCK cells of the influenza virus infection， but fresh root， crude drugs and 2nd have no obvious effect， And showed toxic on cell in a certain concentration range. ConclusionIf there is a blocking effect on the influenza virus infection of Radix Isatidis samples， first may depend on the sample type and quantity of MRPs， second may be associated with the processing methods of Radix Isatidis samples.

Key words：Radix Isatidis; Maillard Reaction; antiviral

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，板藍根具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤以及增強免疫力等作用[1，2]，被廣泛應(yīng)用于治療諸如流感、發(fā)熱、乙肝、腮腺炎等疾病，臨床療效確切。然而中藥區(qū)別于其他藥物的顯著特點是其藥效與炮制、制劑過程密切相關(guān)，中藥湯劑中黑褐色物質(zhì)是其在炮制、煎煮等熱加工過程中產(chǎn)生的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（Maillard Reaction Products，MRPs）[3]，是不同種類的中藥在這些加工過程中最主要的、共同新生物質(zhì)[4]。韓立坤等[5]確認紅參炮制過程中發(fā)生了美拉德反應(yīng)，李向高等[6]測定精氨酸雙糖甙含量在紅參中比生曬參高3倍，并據(jù)此提出控制美拉德反應(yīng)條件對提高紅參加工質(zhì)量有重要意義。本研究旨在確證板藍根在不同加工條件下的美拉德反應(yīng)對其體外抗病毒作用的影響，并分析其可能的作用機理，亦為中藥熱加工過程產(chǎn)生的MRPs是中藥湯劑中的重要藥效成份的假說提供有力的證據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料流感病毒（H1N1亞甲型病毒）由第四軍醫(yī)大學(xué)微生物教研室提供；狗腎上皮細胞（MDCK）由蘭州軍區(qū)總院實驗中心保存；板藍根采購于甘肅省定西市板藍根GAP生產(chǎn)基地。

MEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司；小牛血清購自HyClone公司；MTT購自美國AMRESCO公司。

1.2方法

1.2.1實驗用板藍根提取液的制備鮮根提取液和生藥提取液的制備：分別稱取粉碎后板藍根鮮根和生藥各35g，于100mL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液中充分浸潤，并于4℃攪拌浸提過夜，然后21400g離心15min，收集上清液，即為鮮根樣品和生藥樣品提取液；板藍根孵育樣品的制備：各稱取板藍根生藥50g于60℃，85%濕度下孵育2d與7d（下文簡稱2nd、7th），加入8倍量水，沸水煎煮2次，第1次2h，第2次1h，過濾并合并煎液，21400g離心15min，取上清液定容至155mL，即為2nd、7th樣品提取液。

1.2.2 實驗操作將MDCK細胞用胰酶消化并混勻，稀釋至2.5×105個細胞/mL，于96孔細胞培養(yǎng)板中加200μL/孔細胞懸液，培養(yǎng)24h至MDCK細胞鋪滿孔底，用無菌PBS洗掉細胞表面的小牛血清蛋白。將稀釋好的各濃度樣品加于已長滿單層細胞的96孔板內(nèi)，每濃度4孔，200μL/孔，37℃ 3h后棄樣品液，加100 TCID50病毒液100μL，同時各加100μL的細胞維持液，37℃培養(yǎng) 2h后棄病毒液，加細胞維持液200μL，于37℃、5%CO2 培養(yǎng)。72h后用MTT法于570nm處測OD值。保護率計算公式為：保護率%=（OD570樣品組- OD570病毒組/OD570對照組- OD570病毒組）×100%。

2結(jié)果

2.1板藍根鮮根對MDCK細胞保護實驗板藍根鮮根提取液通過保護細胞而起到抗病毒效果的結(jié)果如圖1所示，不同濃度鮮根提取液細胞組存活率均低于病毒對照組，說明鮮根提取液與細胞作用后，對病毒侵染MDCK細胞不僅沒有保護作用，反而表現(xiàn)出一定程度的毒害作用，但各濃度對MDCK細胞毒害的差異不明顯。

圖1板藍根鮮根提取液對MDCK的保護作用

2.2板藍根生藥對MDCK細胞保護實驗板藍根生藥提取液對MDCK細胞保護實驗結(jié)果見圖2。當生藥濃度為20mg干物質(zhì)/mL時，其對MDCK細胞的保護率為5.7%。當?shù)陀诖藵舛葧r，其對細胞不但沒有保護作用，反而有一定的毒害作用，但各濃度對MDCK細胞毒害作用差異不顯著。

圖2板藍根生藥對MDCK細胞的保護作用

2.3板藍根2nd樣品對MDCK細胞保護實驗板藍根2nd提取液對MDCK細胞的保護實驗結(jié)果見圖3。各濃度2nd樣品與鮮根提取液一樣，對MDCK細胞均沒有保護效果。在病毒侵染細胞情況下，甚至表現(xiàn)出不同程度的毒性作用，樣品濃度越稀，其對細胞的毒害作用越大，但最后亦趨于穩(wěn)定。

圖3板藍根2nd樣品對MDCK細胞的保護作用

2.4板藍根7th樣品對MDCK細胞保護實驗板藍根7th提取液通過保護細胞而起到抗病毒效果的結(jié)果見圖4。由圖可知，7th樣品提取液對MDCK細胞有較好的保護效果。當樣品濃度為31.5mg干物質(zhì)/mL時，其對MDCK細胞的保護率為40.76%，說明7th樣品在適當濃度下，可阻攔病毒侵染細胞。隨著樣品濃度的降低，其對細胞的保護效果逐漸減弱，說明隨著樣品稀釋倍數(shù)的增大，7th樣品中可保護細胞的有效成分減少，對細胞的保護效果亦下降。

圖4板藍根7th樣品對MDCK細胞的保護作用

3討論

藥物體外對抗流感病毒受多種因素的影響，如樣品的處理和加工、質(zhì)量、產(chǎn)地、濃度等。本實驗通過不同處理的板藍根樣品對MDCK細胞的保護作用來考察鮮根、生藥、2nd、7th樣品的抗病毒效果。實驗中先加板藍根各樣品提取液后接種病毒的目的是為了觀察板藍根樣品能否進入細胞或者吸附于細胞表面以阻止病毒的吸附和進入。

實驗結(jié)果顯示，7th樣品對MDCK細胞受流感病毒侵染有顯著的保護作用，而鮮根、生藥、2nd對流感病毒侵染無明顯阻斷作用，且其在一定濃度范圍內(nèi)對細胞表現(xiàn)出毒害作用。說明7th樣品中的MRPs可與細胞膜結(jié)合，競爭性抑制了病毒血凝素HA與MDCK細胞膜唾液酸受體的結(jié)合，或是樣品中MRPs與膜的結(jié)合使得HA結(jié)合位點附近的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使其空間位阻增大，從而保護了MDCK細胞受病毒的侵染。

實驗樣品同為板藍根，卻對病毒表現(xiàn)出不同的阻斷效果，究其原因，可能是因為板藍根不同加工方式使得美拉德反應(yīng)產(chǎn)生MRPs量及種類不同[ ]。因此，板藍根樣品對病毒是否有阻斷作用，一方面可能取決于樣品加工過程中產(chǎn)生MRPs的量和種類，另一方面可能與板藍根樣品加工處理得當與否相關(guān)。本實驗結(jié)論對改善板藍根加工炮制方法具有一定的參考意義。

參考文獻：

[1]程妍，李祥，陳建偉，等．板藍根有效部位的抗病毒藥效研究[J]．南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2011，27（2）：155-157.

[2]高欣，董堞瑾，金鑫，等． 板藍根抗炎活性部位篩選的初步研究[J]． 武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，19( 9) :709．

[3]付莉，李鐵剛. 簡述美拉德反應(yīng)[J]. 食品科技，2006，12:9-11．

[4]A.P.Echavarria， J.Pagan， Albarz. Melanoidins Formed by Maillard Reaction in Food and Their Biological Activity[J]. Food Engineering Reviews，2012，Vol.4(4):203-223.

[5]韓立坤，鄭毅男，胡國宣，等．紅參加工中的梅拉德反應(yīng)[J]．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1994，16(增刊)：68-71．

[6]李向高，鄭毅男，劉墨祥，等．紅參加工中美拉德反應(yīng)及其產(chǎn)物的研究[J]．中國中藥雜志，1999，24(5)：274-279．

[7]Zhanmei Jiang ， Dilip K. Rai ，Paula M. O'Connor ， et al. Heat-induced Maillard reaction of the tripeptide IPP and ribose: Structural characterization and implication on bioactivity[J]．Food Research International， 2013， Vol.50 (1).

編輯/哈濤