紅假單胞菌的分離鑒定及有機(jī)肥鹽度對(duì)其生長(zhǎng)的影響

鐘 倩

（四川省威遠(yuǎn)縣嚴(yán)陵鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，四川 威遠(yuǎn) 642450）

紅假單胞菌屬于光合細(xì)菌的一種，而光合細(xì)菌是一類能在厭氧光照或好氧黑暗條件下利用有機(jī)物作供氫體兼碳源進(jìn)行不放氧光合作用的微生物，在水產(chǎn)養(yǎng)殖、有機(jī)肥生產(chǎn)等方面具有廣泛的應(yīng)用。光合細(xì)菌的生長(zhǎng)受很多因素的影響，而鹽度會(huì)直接影響它的生長(zhǎng)。本文通過(guò)連續(xù)平板涂布法從混合光合細(xì)菌中分離篩選出紅假單胞菌，然后將其接種在有機(jī)肥中進(jìn)行光照厭氧培養(yǎng)，研究有機(jī)肥鹽度對(duì)紅假單胞菌生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1 菌種來(lái)源 光合細(xì)菌菌株由重慶江合生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，紅假單胞菌菌種是從含有紅假單胞菌的二級(jí)光合細(xì)菌菌液中分離純化而得。

1.2 有機(jī)肥樣品 有機(jī)肥由重慶永豐農(nóng)業(yè)綜合開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司提供，產(chǎn)品主要由雞糞經(jīng)過(guò)有氧發(fā)酵而成。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 分離培養(yǎng)基。乙酸鈉3.0g、丙酸鈉0.3g、氯化鈉0.1g、硫酸銨0.3g、七水硫酸鎂0.2g、磷酸氫二鉀0.3g、磷酸二氫鉀 0.5g、氯化鈣 0.05g、硫酸錳 0.025g、酵母膏0.1g、蛋白胨0.1g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL，混合，將pH調(diào)至7.2～7.4，經(jīng)121℃高壓滅菌30min，即成固體分離培養(yǎng)基。再用同樣的培養(yǎng)基分離富集紅假單胞菌和擴(kuò)大培養(yǎng)分離出的菌種。

1.3.2 不同鹽度有機(jī)肥培養(yǎng)基的配制。取無(wú)菌培養(yǎng)皿12個(gè)，6個(gè)梯度鹽度，每個(gè)梯度配制2個(gè)培養(yǎng)基。取100g有機(jī)肥溶于100mL水中，通過(guò)加入NaCl母液調(diào)控每個(gè)鹽度梯度，再加入瓊脂2g，121℃下高壓滅菌20min，即成有機(jī)肥培養(yǎng)基。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌種培養(yǎng)方法。將配制好的培養(yǎng)基分裝于150mL錐形瓶中，裝液量為120mL，用8層紗布牛皮紙封口，液面鋪一層無(wú)菌液體石蠟隔絕氧氣，121℃下滅菌20 min。接種純菌種5%，于光照恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 72～96h（溫度 28～31℃，光照強(qiáng)度 1500～3000勒克斯）。

1.4.2 菌種分離。從重慶江合生物技術(shù)有限責(zé)任公司取來(lái)的菌種本身是經(jīng)過(guò)富集的優(yōu)勢(shì)種為紅螺菌科的菌液，因此通過(guò)分離培養(yǎng)基反復(fù)震蕩培養(yǎng)和分離，重復(fù)幾次，直至鏡檢出純培養(yǎng)物，即可得到分離后的菌種懸浮液。將配制好的分離培養(yǎng)基分別制成無(wú)菌固體瓊脂培養(yǎng)基和無(wú)菌液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基滅完菌加2%酒精。挑取紅色單個(gè)菌落，劃線接種于固體培養(yǎng)基上，表層再覆蓋無(wú)菌瓊脂，制成厭氧培養(yǎng)基，光照厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30℃、3000勒克斯（lx）光照強(qiáng)度。待出現(xiàn)紅色菌落，連續(xù)如此分離3次即可分離出純培養(yǎng)假單胞菌株。觀察菌落形態(tài)特征，鏡檢確定為純培養(yǎng)物，然后做細(xì)菌標(biāo)本片，觀察菌體形態(tài)特征。最后挑取純培養(yǎng)物穿刺于半固體瓊脂柱中，上面覆蓋一層約2 cm高的無(wú)菌混合石蠟，待長(zhǎng)出豐滿的穿刺物后，備用或作菌種保存。配制液體培養(yǎng)物：挑取純培養(yǎng)物于之前配制好的滅菌液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基上面鋪一層1～2 cm液體石蠟，30℃、3 000 lx光照條件下厭氧培養(yǎng)，后期試驗(yàn)備用。

1.4.3 菌種鑒定。革蘭氏染色 ：將純培養(yǎng)物接種于液體培養(yǎng)基中，光照厭氧條件下培養(yǎng)18h左右，對(duì)菌體進(jìn)行革蘭氏染色。菌落形態(tài)、培養(yǎng)特征和菌體形態(tài)學(xué)觀察：待培養(yǎng)皿中長(zhǎng)出菌落時(shí)，觀察瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落形態(tài)及顏色，并制成細(xì)菌標(biāo)本片，在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.4.4 有機(jī)肥不同鹽度的設(shè)置。鹽度設(shè)置為6個(gè)梯度，分別為 0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，每個(gè)梯度設(shè)置2個(gè)重復(fù)，鹽度采用NaCl母液調(diào)控，28℃下光照厭氧恒溫箱中培養(yǎng)。

1.4.5 紅假單胞菌的計(jì)數(shù)。采用平板菌落計(jì)數(shù)法將之前保存好的菌種懸液依次稀釋至 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，在振蕩機(jī)上振蕩，使菌液充分混合。每個(gè)梯度的鹽度設(shè)2個(gè)培養(yǎng)皿，分別加入10-7稀釋度的菌種液，每個(gè)梯度2個(gè)重復(fù)。用2支1mL無(wú)菌吸管分別吸取10-7的稀釋液各0.1mL，放入已做好的含不同鹽度值有機(jī)肥培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用無(wú)菌玻璃棒將菌液涂布均勻，并覆蓋一層液體石蠟，立即放入同一生化培養(yǎng)箱中，調(diào)至30℃、3000lx下進(jìn)行光照厭氧培養(yǎng)。48h后，取出培養(yǎng)平板，對(duì)各培養(yǎng)皿中形成的菌落計(jì)數(shù)，算出不同稀釋度、相同鹽度的平板上形成的平均菌落個(gè)數(shù)，并按下列公式進(jìn)行計(jì)算：1mL菌種懸浮液中菌落形成單位（cfu）＝菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×10。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 分離菌落的形態(tài)特征 挑取3株菌株在平板上劃線培養(yǎng)（黑暗好氧條件下），分別編號(hào) A1、A2、A3，第5d觀察到菌株均生長(zhǎng)良好，然后經(jīng)分離培養(yǎng)基連續(xù)3次平板劃線培養(yǎng)后，分離出單個(gè)菌落，觀察其形態(tài)特征。鏡檢結(jié)果詳見(jiàn)表1。

表1 分離菌落的形態(tài)特征

2.2 純培養(yǎng)菌株的形態(tài)特征及培養(yǎng)特征 取分離得到的純培養(yǎng)物制作細(xì)菌抹片，分別編號(hào)B1、B2、B3，在顯微鏡下觀察，其形態(tài)學(xué)特征及光照厭氧培養(yǎng)的特征如表2所示。

從表1、表2可知，黑暗好氧條件下，菌種不一定呈紅色，而光照厭氧培養(yǎng)時(shí)，液體呈紅色，說(shuō)明其體內(nèi)不一定含有紅色光和色素，但在光照條件下，它能迅速合成紅色光和色素。

表2 純培養(yǎng)菌株的形態(tài)及光照厭氧培養(yǎng)特征

由表1、表2可以看出，3個(gè)菌株均為卵形或桿狀，以單根極生鞭毛運(yùn)動(dòng)；主要以二分裂或不對(duì)稱分裂為增殖方式；革蘭氏染色呈陰性；厭氧光照和好氧黑暗條件下均能生長(zhǎng)；液體培養(yǎng)的菌種呈紅色。這些特征與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第8版）所描述的紅假單胞菌屬相符，因此該分離出的純培養(yǎng)物為紅假單胞菌屬。

2.3 平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果 詳見(jiàn)表3。

表3 不同鹽度培養(yǎng)基中細(xì)菌的生長(zhǎng)情況

從表3可以看出，紅假單胞菌在給定的鹽度范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，在鹽度為0.4%時(shí)生長(zhǎng)最好，隨著w（NaCl）的繼續(xù)升高，紅假單胞菌的生長(zhǎng)情況直線下降。

3 分析與討論

3.1 鹽度對(duì)紅假單胞菌的影響 有機(jī)肥中鹽度直接影響光合細(xì)菌的生長(zhǎng)。由于培養(yǎng)基的鹽度是由不同離子組成的，鹽度的高低其實(shí)是離子濃度的高低，因此，對(duì)鹽度適應(yīng)能力的不同，顯示了菌株對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收能力的不同。分離出的紅假單胞菌在鹽度為0～0.8%范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好，且在0.4%時(shí)生長(zhǎng)最好，說(shuō)明該菌適應(yīng)低鹽水體。所以應(yīng)根據(jù)不同的水質(zhì)情況，選擇合適的光合菌株。

3.2 鹽度對(duì)培養(yǎng)基的影響 高鹽度的培養(yǎng)基會(huì)降低營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的數(shù)量，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在低鹽度時(shí)比在高鹽度和不加氯化鈉時(shí)要多，低鹽度對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有保護(hù)作用，但隨著濃度的增加，保護(hù)作用隨之降低，當(dāng)濃度達(dá)較高時(shí)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的耐熱性顯著減弱，直接影響培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的保存，最終影響到紅假單胞菌株的生長(zhǎng)繁殖。

4 結(jié)論

采用連續(xù)平板涂布法能從混合光合細(xì)菌中分離篩選出紅假單胞菌；有機(jī)肥中的鹽度直接影響紅假單胞菌的生長(zhǎng)，在鹽度為0～0.8%范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好，且在0.4%時(shí)生長(zhǎng)最好。

[1]吳向華，楊啟銀，劉五星，等.光合細(xì)菌的研究進(jìn)展及其應(yīng)用[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2004，6（2）:35-38.

[2]徐福樂(lè)，縱明，楊峰，等.生物有機(jī)肥的肥效及作用機(jī)理[J].耕作與栽培，2005，（6）:8-9.

[3]李勤生，譚德清，王業(yè)勤.微生物飼料添加劑對(duì)養(yǎng)殖魚類的促長(zhǎng)作用[J].水生生物學(xué)報(bào)，1990，14（4）:368-371.

[4]Larimer FW， Chain P， Hauser L， et al.Complete genome sequence of the metabolically versatile photosynthetic bacterium Rhodopseudomonas Palustris[J].Nat.Biotechnol，2004，22（1）:55-61.

[5]劉芳，王敏，楊慧，等.凈化養(yǎng)殖水體紫色非硫光合細(xì)菌的篩選與鑒定[J].中國(guó)生物工程雜志，2008，28（8）:91-95.

[6]王立超，連巖，張志新.溫度、光照和pH之間的相互關(guān)系對(duì)光合細(xì)菌生長(zhǎng)的影響[J].海洋湖沼通報(bào)，1997，（4）:29-31.

[7]馮波，趙紅衛(wèi)，張迅，等.高活性沼澤紅假單胞菌分離及對(duì)垃圾滲濾液處理的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（24）:13322-13324.

[8]張新英，莫天硯，劉斌.紅假單胞菌的分離及菌種保存試驗(yàn)研究[J].廣西師范學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2001，18（2）:9-12.

[9]姚火春.獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2001:13-14.

[10]肖克宇，陳昌福.水產(chǎn)微生物學(xué)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2004:352-354.

[11]RE布坎南，NE吉本斯，等.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》翻譯組譯.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社，1984:23-28.

[12]倪黎綱，王志鵬，羅方妮，等.氧、光照時(shí)間、pH等理化因子影響光合細(xì)菌生長(zhǎng)的研究[J].內(nèi)陸水產(chǎn)，2004，（3）:41-42.

[13]謝紅剛，王三反，褚潤(rùn).光合細(xì)菌培養(yǎng)條件的研究[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2007，30（5）:19-20.

[14]劉朝陽(yáng)，孫曉慶.影響固體培養(yǎng)基凝固的因素[J].南方水產(chǎn)，2007，3（1）:69-74.