野生小果油茶ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

李國帥，曹福祥，彭繼慶，胥 文，胡雙喜，彭滟鈔

（中南林業(yè)科技大學，湖南 長沙410004）

野生小果油茶ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

李國帥，曹福祥，彭繼慶，胥 文，胡雙喜，彭滟鈔

（中南林業(yè)科技大學，湖南 長沙410004）

為建立一個具有良好穩(wěn)定性和可重復性的野生小果油茶ISSR-PCR反應(yīng)體系，以提取的野生小果油茶總DNA為供試材料，利用單因素試驗，正交試驗設(shè)計L16（45）和方差分析對DNA模板的量,引物濃度，dNTPs濃度，Mg2＋濃度，TaqDNA聚合酶的量5個影響ISSR-PCR反應(yīng)體系的因素進行優(yōu)化研究。確定野生小果油茶ISSRPCR最優(yōu)反應(yīng)體系為：在20 μL的反應(yīng)體系中，DNA模板為30 ng，引物濃度為0.7 μmol/L，dNTPs濃度為0.25 mmol/L，Mg2+濃度為2.0 mmol/L，Taq DNA聚合酶的量為1.75 U。方差分析結(jié)果表明，5個因素對體系的影響均未達到顯著水平，其中引物濃度對反應(yīng)體系影響最大。應(yīng)用建立的體系對5份野生小果油茶樣品進行擴增，證明了該體系具有穩(wěn)定性和可重復性。

野生小果油茶；ISSR-PCR；單因素實驗；正交試驗設(shè)計

小果油茶Camellia meiocarpa又名江西子，小茶，雞心子等[1]，是山茶科山茶屬小喬木。果實可以榨油，油中含不飽和脂肪酸可達90%，是一種優(yōu)質(zhì)食用油。小果油茶野生種群主要分布于中亞熱帶海拔600 m以下的地區(qū)[2]。

ISSR（inter simple sequence repeat，ISSR）分子標記，即簡單重復序列區(qū)間擴增多態(tài)性，是在SSR分子標記技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展的一種微衛(wèi)星分子標記技術(shù)[3]。ISSR分子標記以PCR反應(yīng)為基礎(chǔ)，具有操作簡便、靈敏、快速，所需DNA模板量少，成本低等優(yōu)點。目前，ISSR分子標記技術(shù)已經(jīng)在物種遺傳多樣性，生物種質(zhì)資源鑒定，基因定位，遺傳圖譜構(gòu)建等方面研究獲得廣泛應(yīng)用[4]。不同植物的反應(yīng)體系不僅受到植物材料的影響，還受到dNTPs 濃度、Mg2+濃度、引物濃度、Taq DNA聚合酶濃度等因素影響。本研究擬以野生小果油茶葉片為實驗材料，通過單因素試驗和正交試驗設(shè)計對ISSR-PCR反應(yīng)體系的各個因素進行優(yōu)化，建立野生小果油茶ISSR-PCR最佳的反應(yīng)體系，為下一步的野生小果油茶遺傳多樣性研究和遺傳圖譜的構(gòu)建提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

野生小果油茶葉片樣品采自湖南省瀏陽市文家 市 鎮(zhèn)（28°04′01.85″N，113°58′27.72″E， 海 拔184 m）。采集的葉片要選擇完整、沒有病蟲害的新鮮葉片，用濕紗布擦拭干凈后放入自封袋中，并加入適量的硅膠。用冰盒保存帶回實驗室，置于-70℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

Tris堿、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA ，Ethylene Diamine Tetraacetic Acid) 、Taq DNA聚合酶（Taq plus DNA Polymerase）、三磷酸堿基脫氧核苷酸（dNTPs,deoxyribonucleosde triphosphate）、植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）、200 bp DNA Marker（天根生化科技（北京）有限公司）、ISSR隨機引物（由南京金斯瑞生物科技有限公司合成）。

1.3 主要儀器

超凈工作臺、GILSON移液槍一套、恒溫水浴鍋、高速冷凍離心機、電泳儀、紫外分光光度計、凝膠成像系統(tǒng)、超低溫冰箱、電子天平、渦旋振動儀。

1.4 基因組總DNA的提取與檢測

1.4.1 基因組總DNA的提取

采用天根生化科技（北京）有限公司購買的植物基因組提取試劑盒提取野生小果油茶葉片的基因組DNA，操作步驟按照使用說明書進行。

1.4.2 基因組總DNA的檢測

用1.0%的瓊脂糖凝膠（加入EB的終濃度為0.5 μg/mL）電泳檢測提取的野生小果油茶總基因組DNA的質(zhì)量，用紫外分光光度計測定DNA樣品的純度和濃度。把提取的DNA樣品統(tǒng)一稀釋至一定濃度后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

1.5.1 引物的篩選

經(jīng)查閱文獻資料后[5]，ISSR-PCR反應(yīng)體系確定為（20 μL）：模板DNA 20 ng，Mg2+2.5 mmol/L，dNTPs 0.25 mmol/L， 引 物 0.6 μmol/L，10×PCR Buffer 2.0 μL，Taq DNA聚合酶1.75 U。擴增反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，52℃退火45 s，72℃延伸90 s，35個循環(huán)；72℃延伸7 min；4℃保存。

本實驗所用的ISSR引物序列按照加拿大哥倫比亞大學（UBC）公布的第9套ISSR引物序列，由南京金斯瑞生物科技有限公司進行合成。參照劉本英等[5]和范海艷等[6]篩選出的多態(tài)性高，重復性好的10條引物，用同一個DNA模板進行引物初篩，然后再用2個DNA模板進行復篩。篩選出一條擴增條帶清晰，重復性好的引物用于后續(xù)優(yōu)化實驗。

表1 10條引物堿基序列及Tm值Table 1 Base sequences of 10 primers and theirs annealingtemperatures (Tm)

1.5.2 引物退火溫度的確定

參考不同引物的Tm值，利用梯度PCR確定相應(yīng)引物的最佳退火溫度，梯度設(shè)置為Tm-4，Tm-3，Tm-2，Tm-1，Tm，Tm+1，Tm+2，Tm+3，Tm+4，Tm+5共10個梯度。

1.5.3 ISSR-PCR反應(yīng)體系單因素篩選

PCR擴增體系為20 μL，利用梯度實驗的方法對反應(yīng)體系中DNA模板濃度,引物濃度，dNTPs濃度，Mg2+濃度，TaqDNA聚合酶的量等5個因素進行篩選優(yōu)化（見表2）。

表2 ISSR-PCR體系單因素篩選設(shè)計Table 2 Single factor optimal design of ISSR-PCR reaction system

1.5.4 ISSR-PCR正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素實驗優(yōu)化的結(jié)果用于正交試驗設(shè)計，對DNA模板的量,引物濃度，dNTPs濃度，Mg2+濃度，TaqDNA聚合酶的量這5個影響ISSRPCR反應(yīng)體系的因素做L16（45）正交設(shè)計表[7]（見表3），即在5個因素4個水平上做正交優(yōu)化。每個處理做3個重復。通過統(tǒng)計瓊脂糖凝膠電泳圖上擴增出來的條帶數(shù)，從而確定最佳的野生小果油茶ISSR-PCR反應(yīng)體系。

表3 正交試驗設(shè)計因素及水平Table 3 Factors and levels of orthogonal experimental design

2 結(jié)果與分析

2.1 野生小果油茶基因組DNA的純度和濃度

利用植物基因組提取試劑盒提取的野生小果油茶基因組總DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1所示，電泳條帶清晰明亮，沒有拖帶現(xiàn)象，進樣孔內(nèi)干凈，沒有蛋白質(zhì)雜質(zhì)。前端也沒有RNA 的條帶；通過紫外分光光度計測定OD260和OD280，結(jié)果如下表4，它們的OD260/OD280值在1.7～1.9之間，濃度在30～80 ng/μL之間。這表明試劑盒提取的DNA質(zhì)量和純度都比較高，DNA的濃度也比較高，可以繼續(xù)進行后續(xù)試驗。

圖1 5個樣品的基因組DNA電泳Fig. 1 Electrophoresis pattern of genomic DNA from 5 samples

表4 DNA紫外檢測結(jié)果Table 4 Ultraviolet absorption test of DNA

2.2 ISSR-PCR引物的初篩

根據(jù)參考文獻挑選的10條引物中除引物UBC807外均能擴增出比較清晰的多態(tài)性條帶（見圖2）。但是引物UBC825擴增出的條帶清晰明亮，多態(tài)性高，效果最好。所以選擇引物UBC825進行后續(xù)的條件優(yōu)化實驗。

圖2 10條引物的ISSR-PCR擴增Fig.2 Ten ISSR-PCR amplif i cation of primers

2.3 引物UBC825退火溫度的確定

退火溫度對擴增的條帶穩(wěn)定性和數(shù)目有重要的作用，當退火溫度過高時，引物和模板DNA 之間配對就比較困難，擴增出來的條帶減少甚至擴增不出條帶；當退火溫度過低時，引物和模板之間錯配率增加，擴增出來的條帶增加，影響試驗結(jié)果的準確性。引物UBC825的退火溫度梯度實驗如下圖3所示，在53℃時擴增出來的條帶穩(wěn)定，明亮，試驗確定引物UBC825的最佳退火溫度為53℃。

圖3 引物UBC825的退火溫度對ISSR-PCR擴增體系的影響Fig.3 Effects of UBC825 primer’s annealing temperature on ISSR-PCR amplif i cation system

2.4 ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

2.4.1 模板DNA的量對ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響

模板DNA的量對PCR擴增有比較大的影響，量太少造成分子的碰撞幾率降低，導致偶然性增大，擴增產(chǎn)物出現(xiàn)不穩(wěn)定性；量太大會增加非特異性的產(chǎn)物擴增。如圖4所示，當模板DNA的量小于20 ng時，擴增出來的條帶比較模糊；當模板DNA的量大于 60 ng時，擴增條帶清晰明亮。但有拖尾現(xiàn)象；當模板DNA的量為 30～40 ng時，擴增條帶比較清晰明亮，且擴增帶型基本一致。所以在20 μL的體系中，模板DNA的用量為30～40 ng對ISSR-PCR擴增是比較合適的。

圖4 DNA模板對ISSR-PCR反應(yīng)體系擴增的影響Fig.4 Effects of template DNA on ISSR-PCR amplif i cation system

2.4.2 ISSR引物濃度對ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響

PCR能否擴增出特異性產(chǎn)物取決于引物和DNA模板的互補程度，ISSR引物濃度過低，會導致擴增的量不足，條帶較少；濃度過高會導致產(chǎn)生新的位點。如圖5所示，當ISSR引物濃度小于0.3 μmol/L時，擴增條帶數(shù)少，條帶模糊；當ISSR引物濃度為0.4～0.7 μmol/L時，擴增條帶清新明亮，且擴增的條帶較多；當ISSR引物濃度大于0.8 μmol/L時，擴增條帶模糊。所以，比較適合的ISSR引物濃度為0.6～0.7 μmol/L。

圖5 ISSR引物濃度對ISSR-PCR擴增體系的影響Fig.5 Effects of ISSR primer on ISSR-PCR amplif i cation system

2.4.3 Mg2+濃度對ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響

Mg2+是TaqDNA聚合酶是否具有活性的關(guān)鍵因素。同時，Mg2+的濃度大小會影響PCR的擴增效率，特異性以及退火溫度。如圖6所示，當Mg2+濃度為2.0～3.0 mmol/L時，擴增出來的條帶清晰明亮，帶型基本一致；當Mg2+濃度大于3.5 mmol/L時，擴增的條帶開始變模糊。故較適合的Mg2+濃度為2.0～3.0 mmol/L。

2.4.4 dNTPs濃度對ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響

圖6 Mg2+濃度對ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響Fig.6 Effects of Mg2+ concentration on ISSR-PCR amplif i cation system

底物的濃度會影響到酶促反應(yīng)的效率。dNTPs是Taq DNA聚合酶作用的底物，dNTPs濃度太低會影響合成的效率，甚至可能由于過早的消耗導致產(chǎn)物單鏈化；dNTPs濃度過高又會導致Taq DNA聚合酶錯誤的摻入。故其濃度大小會對ISSR-PCR反應(yīng)產(chǎn)生直接的影響。如圖7所示，dNTPs在6個不同濃度條件下均能擴增出清晰明亮的特異性條帶，但當dNTPs的濃度小于0.15 mmol/L時或大于0.35 mmol/L時，擴增出來的特異性條帶較少，而dNTPs的濃度在0.20～0.30 mmol/L時，擴增出來的特異性條帶多，帶型也基本一致。所以，比較適合的dNTPs的濃度在0.20～0.30 mmol/L之間。

圖7 dNTPs濃度對ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響Fig.7 Effects of dNTPs concentration on ISSR-PCR amplif i cation system

2.4.5TaqDNA聚合酶的量對ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響

在由酶催化的反應(yīng)中，酶存在的量對反應(yīng)有直接影響。ISSR-PCR反應(yīng)是由Taq DNA聚合酶催化的反應(yīng)，當Taq DNA聚合酶用量過少時，酶與底物結(jié)合減少，降低反應(yīng)效率；Taq DNA聚合酶用量過高，不但增加實驗成本，而且容易產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。所以應(yīng)該對Taq DNA聚合酶的用量進行優(yōu)化。 如圖8所示，Taq DNA聚合酶在1.25～2.50 U時均能擴增出產(chǎn)物，但當Taq DNA聚合酶用量小于1.25 U時條帶不夠清晰；Taq DNA聚合酶用量在1.50～2.50 U之間時，擴增條帶比較清晰，帶型也基本一致，故Taq DNA聚合酶用量可以選擇在1.50～2.50 U之間。

2.4.6 ISSR-PCR反應(yīng)體系正交試驗設(shè)計優(yōu)化結(jié)果直觀分析

圖8 Taq DNA聚合酶的量對ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響Fig.8 Effects of amount of Taq DNA polymerase on ISSRPCR amplif i cation system

根據(jù)上文單因素實驗篩選出的各因素的濃度（20 μL的ISSR-PCR反應(yīng)體系）分別為：DNA模板20～50 ng，引物0.4～0.7 μmol/L，dNTPs 0.15～0.30 mmol/L，Mg2+2.0～3.5 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.5～2.25 U。據(jù)此在5因素4水平上進行正交試驗設(shè)計（見表2）對ISSR-PCR反應(yīng)的最佳體系進行摸索篩選。實驗結(jié)果如下圖9所示。正交試驗的16組中除3號組外均擴增出特異性條帶，其中7、8、15組合擴增出來的條帶比較清晰，特異性也很豐富，尤以組合7（DNA模板30 ng，引 物 0.7 μmol/L，dNTPs 0.25 mmol/L，Mg2+2.0 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.75U）擴增的效果最好。

2.4.7 ISSR-PCR反應(yīng)體系正交試驗設(shè)計優(yōu)化結(jié)果數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計的原則為，在瓊脂糖凝膠電泳圖中，條帶清晰可辨的計為1，模糊不清或缺失的計為0。統(tǒng)計瓊脂糖凝膠電泳圖中每個組合擴增出的條帶數(shù)，然后對所得數(shù)據(jù)進行極差分析。結(jié)果見下表5。其中，Ki(i=1、2、3、4)代表同一個因素在同一水平下的不同組合之間的總條帶數(shù)，R表示同一因素在不同水平之間的極差值。極差值可以反映每個因素對體系的影響程度，值越大，表明該因素對體系的影響越大。通過表5中R值可以看出，引物的極差值最大，為3.25，說明在野生小果油茶ISSR-PCR反應(yīng)體系中，引物對該體系的影響最大；dNTPS和TaqDNA 聚合酶的極差值為1.75，DNA模板和Mg2+的極差值為1.50，這4個因素對反映體系影響的差別不大。

圖9 正交試驗設(shè)計結(jié)果Fig.9 Results of orthogonal experimental design

對各因素的數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果見表6。實驗結(jié)果表明，這5個因素對野生小果油茶ISSRPCR反應(yīng)體系的影響差異均不顯著，其中引物濃度對反應(yīng)體系的影響最大。通過做各因素的效應(yīng)曲線圖（圖10）可以看出，DNA模板30 ng、40 ng時對體系的效應(yīng)最高，其次是50 ng，效應(yīng)最低的是20 ng。dNTPs效應(yīng)與DNA模板的恰好相反，低濃度和高濃度時效應(yīng)較高。引物的最佳效應(yīng)濃度為0.7 mmol/L。Mg2+的效應(yīng)隨著濃度的增加總體呈降低趨勢。而Taq DNA聚合酶的濃度在1.75 U時效應(yīng)最高。根據(jù)極差、方差分析，各因素效應(yīng)曲線圖，實際瓊脂糖電泳圖效果結(jié)合試驗成本，確定野生小果油茶ISSR-PCR反應(yīng)體系為：DNA模板為30 ng，引物濃度為0.7 μmol/L，dNTPs濃度為0.25 mmol/L，Mg2+濃度為2.0 mmol/L，Taq DNA聚合酶的量為1.75 U。

2.5 ISSR-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定性檢驗

利用引物UBC825對其中5份樣品進行ISSRPCR擴增，結(jié)果如圖11所示，通過實驗優(yōu)化過的ISSR-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定性強，重復性高，擴增條帶分離清晰，多態(tài)性高，特異性豐富。證明正交試驗設(shè)計優(yōu)化的野生小果油茶ISSR-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定可靠，能夠應(yīng)用于后續(xù)實驗研究。

3 討 論

本研究通過對野生小果油茶ISSR-PCR反應(yīng)體系中的DNA模板，引物，dNTPs濃度，Mg2+，Taq DNA聚合酶5個影響因素進行單因素試驗，首先確定了5個因素適應(yīng)反應(yīng)體系的濃度范圍，然后通過正交試驗設(shè)計，確定了野生小果油茶ISSR-PCR反應(yīng)的最佳體系，即在20 μL的反應(yīng)體系中，DNA模板為30 ng，引物濃度為0.7 μmol/L，dNTPs濃度為0.25 mmol/L，Mg2+濃度為2.0 mmol/L，TaqDNA聚合酶的量為1.75 U。

實驗表明，引物濃度對反應(yīng)體系的影響最大，這主要因為PCR擴增是在引物的指導下合成的。在反應(yīng)過程中，引物與Mg2+和dNTPs形成復合物[8-9]，引物的濃度決定復合物解離的速度，這與王彥華等[10]利用正交設(shè)計優(yōu)化不結(jié)球白菜ISSR反應(yīng)體系的研究得出的結(jié)論是一致的。不同的植物進行ISSR-PCR擴增要求不同的引物，即使引物相同，濃度也會產(chǎn)生差異。ISSR引物的濃度太低，會出現(xiàn)引物的競爭，從而導致模板的某些位點不能擴增出來，出現(xiàn)多態(tài)性差異的假象[11]，降低實驗結(jié)果的可靠性。ISSR引物濃度過高時，則會出現(xiàn)非特異性條帶，同時容易產(chǎn)生引物二聚體，影響目標條帶的擴增[12]。不同植物的ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系差別很大，5個因素對體系的影響也存在很大差異。如彭繼慶等[13]得到Mg2+是體系的主要影響因素，梁文匯等[14]得到的是Taq DNA聚合酶是影響最大的因素，而李慧慧等[15]建立的栝樓ISSR-PCR體系Taq DNA聚合酶是影響最小的因素，用量也僅需0.5 U。

表5 正交試驗設(shè)計數(shù)據(jù)分析Table 5 Data analysis of orthogonal test design

表6 正交試驗設(shè)計方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal experimental design

圖10 各因素效應(yīng)曲線Fig.10 Effect curves of every factor

圖11 5個樣品對ISSR-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定性檢驗結(jié)果Fig.11 Inspection result of 5 samples on stability of ISSRPCR reaction system

各種植物的ISSR-PCR體系報道已有很多，但大多采用單因素實驗。本試驗所采用的正交試驗設(shè)計具有均衡分散，綜合可比，效果明確等特點[16-20]，同時對實驗數(shù)據(jù)進行了極差值分析，方差分析，并作出了各因素的效應(yīng)曲線圖，避免了直觀分析人為因素影響結(jié)果的準確性。建立的ISSR-PCR反應(yīng)體系具有良好的穩(wěn)定性和可重復性。為以后小果油茶的遺傳多樣性研究，指紋圖譜的構(gòu)建，品種鑒定及育種提供了理論基礎(chǔ)。

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Establishment and optimization of ISSR-PCR reaction system of Camellia meiocarpa Hu.

LI Guo-shuai, CAO Fu-xiang, PENG Ji-qing, XU Wen, HU Shuang-xi, PENG Yan-chao
(Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

In order to establish a stability and repeatability reaction system of wildCamellia meiocarpa, fi ve factors, the concentration of DNA template, primers, dNTPs, Mg2+andTaqDNA polymerase, were studied by the single factor tests, orthogonal experimental design L16（45）and variance analysis, with the total DNA ofCamellia meiocarpaas an experimental material. The PCR amplif i cation reaction process was optimized. The optimal system of ISSR-PCR reaction system was established as follows: 30 ng DNA temple, 0.7 μmol/L primers, 0.25 mmol/L dNTPs, 2.0 mmol/L Mg2+, 1.75U Taq DNA polymerase were contained in 20 μL reaction system. The variance analysis shows that the effects of 5 factors on the system did not reach a signif i cant level, and of them, the primer concentration had the greatest impact on the reaction system. The established system was applied in the amplif i cations of 5 varieties of wildCamellia meiocarpaHu, and the results indicated the system had stability and repeatability．

wildCamellia meiocarpa; ISSR-PCR reaction system; single factor experiment; orthogonal experimental design

S794.4

A

1673-923X(2014)04-0036-07

2013-08-31

“生物化學與分子生物學”校級重點學科基金（066）

李國帥（1988-），男，河南安陽人，碩士研究生，從事生物化學與分子生物學研究

曹福祥（1962-），男，湖南新化人，教授，博士，博士生導師，主要從事生物化學與分子生物學研究：

E-mail：csfucao@163.com

[本文編校：吳 彬]