魚腥草多糖提取工藝及抗氧化活性研究

來林康，鄧尚貴(浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山316004)

魚腥草(Houttuynia cordata)，又名折耳根，屬于雙子葉植物三白草科蕺菜屬。它是一種略帶魚腥味的草本植物，是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食同源的食材之一［1］。魚腥草具有清熱解毒、消腫排膿、利尿通淋的功效，主要用于肺膿瘍、痰熱咳嗽、熱痢熱淋、痛瘡腫毒［2］，其主要成分為:魚腥草多糖、黃酮類、生物堿、甾醇類、維生素等［3］。

多糖是指由單糖聚合而成的一類生物大分子，具有多種生物活性。研究表明，魚腥草多糖具有抗病毒作用:魚腥草水提物對(duì)血熱病毒(EHFV)有一定抑制作用［4］;魚腥草是很好的免疫調(diào)節(jié)劑:它能增強(qiáng)白細(xì)胞的吞噬功能［5］;魚腥草還具有較強(qiáng)的抗氧化活性［6］，國(guó)內(nèi)外已將抗氧化檢測(cè)用于抗衰老等保健食品的評(píng)價(jià)［7－8］。魚腥草多糖具有低毒低害、來源廣泛的特點(diǎn)，已成為近年來的研究熱點(diǎn)。但目前魚腥草多糖提取率不高，且沒有具體提取工藝，難以推廣。

筆者以新鮮魚腥草作為提取原料，采用正交試驗(yàn)確定魚腥草多糖提取最佳工藝，提高多糖提取率并對(duì)魚腥草多糖抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為開發(fā)魚腥草藥物及功能性食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 供試原料:新鮮魚腥草購于舟山臨城菜場(chǎng)。主要試劑:1，1-二苯基-2-苦基肼基(DPPH)，美國(guó) sigma 公司;鄰二氮菲、磷酸緩沖液、鄰苯二酚、乙醇(無水)、濃硫酸(98%)、鹽酸、氯仿、正丁醇、苯酚、硫酸亞鐵等，均為分析純。主要儀器與設(shè)備:CLF-30B超微粉碎機(jī)，新昌關(guān)紅利數(shù)控制造廠;79HW-1恒溫磁力攪拌器，金壇國(guó)旺實(shí)驗(yàn)儀器廠;CR21G冷凍離心機(jī)，日本日立;A-1502紫外分光光度計(jì)，上海譜元;PlusTM 4.5Liter Casade冷凍干燥機(jī)，LABCONCO;CA-1111 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，EYELA;常用儀器等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 魚腥草粉末的制備。魚腥草經(jīng)清水洗凈，烘干并粉碎，過200目篩除雜，放入4℃冰箱冷藏備用。

1.2.2 魚腥草多糖的制備。取20 g魚腥草粉末，加入10 ml HCl靜置15 min，加水20倍量、30倍量、40倍量于70～90℃恒溫?cái)嚢杼崛?、5、6 h，抽濾，得濾液于4℃冰箱預(yù)冷。取預(yù)冷液，加入Sevag試劑(V樣品∶V氯仿∶V正丁醇=20∶4∶1)脫蛋白，靜置，直至無雜蛋白，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，加入無水乙醇反復(fù)提純，沉淀冷凍干燥得魚腥草多糖粗品。

1.2.3 魚腥草多糖含量測(cè)定。試驗(yàn)采取苯酚－硫酸法測(cè)定魚腥草多糖含量，參照2005版《中國(guó)藥典》［1］執(zhí)行。

1.2.4 單因素試驗(yàn)。分別研究不同提取時(shí)間、提取溫度、浸提次數(shù)、料液比對(duì)魚腥草多糖提取率影響。提取時(shí)間分別為1、3、5、7、9 h;提取溫度分別為 50、60、70、80、90 ℃;浸提次數(shù)分別為 1、2、3、4、5 次;料液比分別為 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/ml。

1.2.5 正交試驗(yàn)法優(yōu)化酸法提取魚腥草多糖工藝。在單因素試驗(yàn)研究基礎(chǔ)上，對(duì)魚腥草多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，采用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)［9］。以多糖提取率作為衡量指標(biāo)。

1.2.6 抗氧化活性研究。以羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基清除率為指標(biāo)［10］研究魚腥草多糖的抗氧化活性。

1.2.6.1 羥自由基清除率測(cè)定。采用鄰二氮菲法，取0.75 mmol/L 鄰二氮菲1.0 ml，pH 7.4 的 PBS 2.0 ml，蒸餾水 1.0 ml，混合均勻，加入 0.75 mmol/L 硫酸亞鐵 1.0 ml，0.12% 雙氧水1.0 ml(新鮮配制)，振蕩混勻，記作 Ap;以1.0 ml蒸餾水代替1.0 ml的0.12%的雙氧水，其余條件同Ap處理記作Ab;以1.0 ml樣液代替1.0 ml蒸餾水，其余條件同Ap處理記作 As。Ap、Ab、As均在37 ℃ 水浴鍋中保溫 60 min，然后蒸餾水調(diào)零，測(cè)定波長(zhǎng)536 nm處吸光度，并計(jì)算羥自由基清除率。

1.2.6.2 超氧陰離子自由基清除活性的測(cè)定。取鄰苯三酚0.1 ml并加入 Tris-HCl(pH 8.2)緩沖溶液 5 ml于試管中，加入樣液0.25 ml，迅速混勻，25℃水浴保溫15 min后使用1 cm比色皿，以蒸餾水做空白對(duì)照，在波長(zhǎng)320 nm處時(shí)測(cè)吸光度Ai，并測(cè)定扣除本底自身的干擾，樣液對(duì)超氧陰離子自由基清除率按下式計(jì)算:

清除率 S=［A0－(Ai－Aj)］/A0×100%

式中，A0為試劑空白的吸光度值;Ai為樣液的吸光度值;Aj為樣液本底的吸光度值。

1.2.6.3 DPPH自由基清除活性的測(cè)定。稱取適量魚腥草多糖溶于10 ml蒸餾水，溶解后分別取1 ml至反應(yīng)體系，其中樣品組為1 ml DPPH+1 ml樣品;對(duì)照組1為1 ml 95%乙醇+1 ml樣品;對(duì)照組2為1 ml蒸餾水+1 ml DPPH;調(diào)零組為95%乙醇?；旌暇鶆?，避光反應(yīng)30 min。檢測(cè)各組在波長(zhǎng)535 nm處的吸光度，依次記為A1、A2、A3，計(jì)算清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)魚腥草多糖提取率及含量的影響。由圖1可知，在1～9 h，多糖提取率隨提取時(shí)間增加而增加，這是由于酸提多糖的過程是原料中多糖成分不斷溶出并向水中擴(kuò)散的過程。最初水溶液中多糖含量較低，而魚腥草組織內(nèi)含量較高，則內(nèi)外形成濃度梯度，多糖物質(zhì)易從魚腥草內(nèi)部向周圍水溶液擴(kuò)散的動(dòng)力較大，因此提取時(shí)間增加，多糖提取率升高。隨著提取的過程，水溶液中的多糖物質(zhì)逐漸增多，濃度升高，而同時(shí)魚腥草組織內(nèi)，多糖含量逐漸降低，則內(nèi)外濃度梯度不斷減小，最終內(nèi)外多糖濃度趨于平衡，所以在5～9 h，多糖提取率增長(zhǎng)緩慢，因此酸法提取魚腥草多糖提取時(shí)間選擇5 h適宜。

2.1.2 提取溫度對(duì)魚腥草多糖提取率及含量的影響。由圖2可知，在50～80℃的溫度范圍內(nèi)，隨溫度升高，提取率也隨之升高，在80℃提取率達(dá)到最大值。隨后，多糖提取率隨溫度升高而降低，有可能是因?yàn)闇囟雀?，易造成多糖析出過程中多糖降解，從而是提取率降低。所以酸法提取魚腥草多糖提取溫度選擇80℃適宜。

2.1.3 浸提次數(shù)對(duì)魚腥草多糖提取率及含量的影響。由圖3可知，多糖提取率隨浸提次數(shù)增加緩慢升高，原因可能是當(dāng)水進(jìn)入魚腥草組織細(xì)胞時(shí)，由于滲透作用，水逐漸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，溶解多糖，形成內(nèi)外多糖濃度差。于是魚腥草組織內(nèi)多糖物質(zhì)不斷涌出，水不斷滲入細(xì)胞內(nèi)，循環(huán)往復(fù)，直至細(xì)胞內(nèi)外多糖濃度差達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。連續(xù)多次過濾魚腥草溶液，連續(xù)多次加水，就可以把所需成分大部分溶出。所以隨浸提次數(shù)增加，多糖提取率升高。但從圖3可以看出，浸提次數(shù)增加，多糖提取率增加較為緩慢，原因可能為魚腥草多糖細(xì)胞壁并未被破壞完全，導(dǎo)致多糖物質(zhì)無法從中析出。綜合考慮，酸法提取魚腥草多糖浸提次數(shù)選擇3次。

2.1.4 料液比對(duì)魚腥草多糖提取率及含量的影響。由圖4可知，在料液比1∶10 ～1∶40 g/ml，多糖提取率隨之升高，在料液比1∶40 g/ml處，達(dá)到最大值。魚腥草組織細(xì)胞含有細(xì)胞壁，多糖物質(zhì)為大分子物質(zhì)，外界環(huán)境水滲透入細(xì)胞，溶解多糖物質(zhì)，但多糖物質(zhì)不易流出細(xì)胞。水溶液加酸，可以有效破壞細(xì)胞壁，能讓溶解的多糖物質(zhì)流出細(xì)胞，提高提取效率。料液比1∶40～1∶50 g/ml，多糖提取率隨之降低。可能是酸液濃度過高，破壞了細(xì)胞結(jié)構(gòu)，造成多糖物質(zhì)析出后降解，降低提取率。結(jié)合圖4，酸法提取魚腥草多糖最佳料液比為1∶40 g/ml。

以上單因素試驗(yàn)可知，魚腥草多糖提取最佳條件為:提取時(shí)間5 h、提取溫度80℃、浸提次數(shù)3次、料液比1∶40 g/ml。

圖1 提取時(shí)間對(duì)魚腥草多糖提取率影響

圖2 提取溫度對(duì)魚腥草多糖提取率影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素水平設(shè)計(jì)見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。根據(jù)L9(34)正交表，對(duì)多糖提取率進(jìn)行分析，最優(yōu)水平選擇:對(duì)于因數(shù)A有K3j＞K2j＞K1j，表明浸提時(shí)間為6 h時(shí)提取率最高;對(duì)于因數(shù)B有K1j＞K2j＞K3j，表明浸提溫度為70℃時(shí)最好;對(duì)于因數(shù)C有K1j＞K3j＞K2j，表明浸提次數(shù)為1次時(shí)最好;對(duì)于因數(shù)D有K3j＞ K2j＞ K1j，表明料液比為 1∶40 g/ml時(shí)提取率最高。綜合可得酸提魚腥草多糖的最優(yōu)組合是B1A3C1D3，即浸提溫度70℃、浸提時(shí)間6 h、浸提次數(shù)1次、料液比1∶40 g/ml。極差分析表明，在4個(gè)因素中，影響魚腥草多糖提取的主次順序?yàn)锳(浸提時(shí)間)＞B(浸提溫度)＞D(料液比)＞C(浸提次數(shù))。其中A(浸提時(shí)間)是酸提魚腥草多糖的主要影響因素，C(浸提次數(shù))對(duì)多糖提取影響最小，B(浸提溫度)和D(料液比)因素的影響不顯著。

圖3 浸提次數(shù)對(duì)魚腥草多糖提取率影響

圖4 料液比對(duì)魚腥草多糖提取率及含量的影響

表1 正交試驗(yàn)因素水平

表2 魚腥草多糖提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

方差分析顯示，F(xiàn)A=2.313，F(xiàn)B=0.970，F(xiàn)C=0.465，F(xiàn)D=0.252，F(xiàn)臨界=4.460，F(xiàn)0.01(2，2)=99.00，F(xiàn)0.05(2.2)=19.00。因此只有因素A對(duì)分析結(jié)果影響顯著。

2.3 抗氧化活性

2.3.1 羥自由基清除率。由圖5可見，鄰二氮菲在溶液pH 7.2～7.4條件下，與 Fe2+離子反應(yīng)，變成橘紅色，但與 Fe3+離子不反應(yīng)。PBS緩沖液維持了溶液穩(wěn)定的pH，加入樣品物質(zhì)，使Fe3+還原為Fe2+，觀察溶液顏色，顏色越深，代表樣品物質(zhì)抗氧化活性越強(qiáng)。分析可得:羥自由基清除率隨濃度升高變強(qiáng)，0.2 ～0.6 mg/ml，清除率明顯低于 VC;多糖濃度達(dá)0.6～1.0 mg/ml，清除率趨于平穩(wěn)，基本可達(dá)80%，與 VC對(duì)比清除率相差不多。

圖5 不同濃度自由基清除率

2.3.2 超氧陰離子自由基清除率。由圖5可見，鄰苯三酚在堿性條件下發(fā)生自氧化釋放超氧陰離子，并生成有色中間產(chǎn)物，該有色中間產(chǎn)物在320 nm波長(zhǎng)處有一特征吸收峰，當(dāng)有抑制劑存在時(shí)，可清除超氧陰離子自由基，從而阻止中間產(chǎn)物的積累。分析可得，0.2～0.4 mg/ml，清除率很低，效果不明顯;0.6～1.0 mg/ml，清除率較為穩(wěn)定，但是也并不高，平均可達(dá)70%。

2.3.3 DPPH自由基清除率。DPPH自由基是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，其溶液具有特征的紫紅色吸收峰，當(dāng)存在自由基清除劑時(shí)，由于與其單電子配對(duì)而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其所接受的單電子數(shù)成定量關(guān)系，因而可用分光光度法進(jìn)行定量分析。分析可得(圖5):0.2～0.4 mg/ml，清除率較低，平均只有 20%;0.6～1.0 mg/ml，清除率增長(zhǎng)很快，幾近與VC持平，效果很好。

綜合得出，魚腥草多糖對(duì)超氧陰離子自由基清除率并不明顯，隨著濃度增加，清除率也并不明顯;0.6～1.0 mg/ml，羥自由基清除率、DPPH清除率都具有較好的效果，相對(duì)靠近VC清除率，但還是與之有一定差距。

以上清除率試驗(yàn)可得，多糖濃度0.2～0.4 mg/ml，對(duì)3種自由基清除率都不高，效果不明顯增加。0.6～1.0 mg/ml，對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基清除率都具有較好的效果。

2.4 優(yōu)化工藝驗(yàn)證 因單因素試驗(yàn)結(jié)果與正交試驗(yàn)不一致，因此進(jìn)行優(yōu)化驗(yàn)證。根據(jù)單因素試驗(yàn)得出結(jié)果，平行做3次提取試驗(yàn)，得到平均提取率為2.3%;同樣正交試驗(yàn)得出結(jié)果，平行做3次提取試驗(yàn)，得到平均提取率為4.5%。證明優(yōu)化工藝可行［10］。

3 結(jié)論與討論

根據(jù)單因素試驗(yàn)得出提取條件:提取溫度80℃、提取時(shí)間7 h、浸提次數(shù)1次、料液比1∶40 g/ml。而正交試驗(yàn)表明最佳提取條件為:浸提溫度70℃、浸提時(shí)間6 h、浸提次數(shù)1次、料液比1∶40 g/ml。提取溫度、浸提時(shí)間、料液比相對(duì)有所下降，進(jìn)一步說明浸提時(shí)間、浸提溫度對(duì)提取過程有較大的影響，驗(yàn)證了方差分析結(jié)果。優(yōu)化后工藝縮短了提取時(shí)間，降低了提取溫度，能有效節(jié)約提取過程中能源，降低能耗，說明優(yōu)化工藝可行。

根據(jù)抗氧化試驗(yàn)得出:魚腥草多糖具有一定的抗氧化能力，對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基具有較好的清除效果。試驗(yàn)數(shù)據(jù)可得:魚腥草多糖清除羥自由基、超氧陰離子自由基效果較好，可能與多糖結(jié)構(gòu)有關(guān)，因?yàn)槎嗵墙Y(jié)構(gòu)是生物活性的基礎(chǔ)。因此需要更一步做好分離純化步驟，這一部分工作還有待進(jìn)行。

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