4種常用食用菌子實(shí)體多糖抗氧化活性的比較

解春艷，秦 靜，韓 爽，段秀霞

(1.廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)院，河北廊坊065000;2.河北省高校食藥用真菌資源與應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，河北廊坊065000)

生物體在新陳代謝過(guò)程中不斷地產(chǎn)生自由基。通常情況下，自由基在機(jī)體內(nèi)的生成和去除處于平衡狀態(tài)，不會(huì)對(duì)身體造成嚴(yán)重?fù)p傷，但是當(dāng)機(jī)體內(nèi)的自由基過(guò)剩時(shí)，會(huì)引起如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的氧化損傷［1］，進(jìn)而導(dǎo)致諸如衰老、癌癥、心腦血管疾病及冠心病等多種疾病的發(fā)生，抗氧化劑對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用，主要通過(guò)其抑制自由基的產(chǎn)生或直接清除自由基等來(lái)實(shí)現(xiàn)［2］。

食用菌是一種公認(rèn)的安全微生物資源，其天然無(wú)毒、營(yíng)養(yǎng)豐富，其中部分品種還可藥食兼用。報(bào)道稱食用菌中含有多糖、蛋白質(zhì)、三萜類化合物等多種功效成分，因而其具有提高機(jī)體免疫力、延緩衰老等功能［3］。

多糖作為食用菌功效成分的一種，也是現(xiàn)今食用菌集中研究的方向。目前，對(duì)其研究主要在多糖的提取、純化及生物活性上。王廣慧等采用超聲波協(xié)同高壓熱水浸提法對(duì)香菇多糖進(jìn)行提取，在優(yōu)化的工藝下，多糖的提取率可達(dá)15.4%［4］;李磊等對(duì)真菌多糖的提取、純化等方法進(jìn)行了綜述，總結(jié)了目前真菌多糖在提取和純化中所用的方法［5］;金城報(bào)道了真菌多糖的抗氧化活性并指明其對(duì)生物膜的保護(hù)作用［6］。此外，多名學(xué)者對(duì)真菌多糖的生物活性進(jìn)行研究或是對(duì)研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述［7－8］，而對(duì)常見(jiàn)食用菌活性比較研究的報(bào)道較少。筆者選取的4種常用食用真菌——香菇、杏鮑菇、蟹味菇及茶樹(shù)菇，經(jīng)浸提及純化后獲得子實(shí)體多糖，比較4種子實(shí)體多糖對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基的清除作用及其總還原力等體外抗氧化活性，旨在為對(duì)食用菌資源的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 原料:香菇、杏鮑菇、蟹味菇和茶樹(shù)菇子實(shí)體，均購(gòu)自元辰超市。主要試劑:葡萄糖，磷酸二氫鉀，硫酸鎂，磷酸氫二鈉，維生素B1，鹽酸，氫氧化鈉，氯仿，正丁醇無(wú)水乙醇，10.5 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 6.6)，1%鐵氰酸鉀溶液［K3Fe(CN)6］，三氯乙酸溶液(TCA)，蒸餾水，0.1% 三氯化鐵溶液，硫酸亞鐵，9.0 mmol/L 水楊酸鈉，8.8 mmol/L H2O2，鄰苯三酚，50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.2)緩沖液，5% 抗壞血酸。

主要儀器:BS-2F振蕩培養(yǎng)箱，國(guó)華電器有限公司;冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;TDL-40B低速臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;S22PC型分光光度計(jì)，上海棱光有限公司;LS-3750高壓蒸汽滅菌鍋，SANYO;HH-4，HH-6恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司;FA2004B電子分析天平，上海精密儀器有限公司;ZHTH-C1115C智能型安全超凈工作臺(tái)，上海智城分析儀器制造有限公司;BCD-256KF低溫冰箱，青島海爾股份有限公司;ZRD-5210恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)流程。食用菌子實(shí)體清洗→烘干→粉碎→子實(shí)體粉末→子實(shí)體多糖的提取→乙醇沉淀→純化→抗氧化活性測(cè)定。

1.2.2 食用菌子實(shí)體粉末制備。將購(gòu)買(mǎi)的4種食用菌子實(shí)體洗凈，于50℃鼓風(fēng)干燥箱中烘至恒重，置高速組織攪拌機(jī)中粉碎成粉末，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 食用菌子實(shí)體多糖提取及純化。稱取一定量的子實(shí)體粉末，按料液比1∶20～1∶30 g/ml的比例加入蒸餾水，攪勻，用氫氧化鈉溶液將pH調(diào)至8.0，在提取溫度90℃下浸提2 ～3 h［9－11］，而后將浸提液于 4 000 r/min 下離心 30 min，棄沉淀得上清液;取上清液置于燒杯中加入4倍體積的無(wú)水乙醇，攪拌后靜置1 h，4 000 r/min離心15 min，棄上清，得沉淀;沉淀為提取的粗多糖。將粗多糖置于150 ml三角瓶中，用50 ml 90℃蒸餾水(熱水)復(fù)溶，經(jīng)Sevag法去除蛋白［12－14］后，采用真空冷凍干燥法將純化的多糖干燥，獲得子實(shí)體多糖粉。

1.3 多糖抗氧化性能測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 總還原力的測(cè)定。分別取 0.5、1.0、2.0、4.0 和 8.0 mg/ml的樣品溶液 1.0 ml，依次加入 3.0 ml 0.5 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 6.6)和2.5 ml 1%鐵氰化鉀溶液［K3Fe(CN)6］，于50 ℃水浴20 min，快速冷卻后，加入2.5 ml 10%三氯乙酸溶液(TCA)，以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液 2.5 ml，依次加入2.5 ml蒸餾水，0.5 ml 0.1%三氯化鐵溶液，充分混勻，靜置10 min后，于700 nm下測(cè)定其吸光值，以蒸餾水作參比［15－16］。

1.3.2 羥自由基清除能力測(cè)定。參照盛偉等的方法［7］，并略有改動(dòng)。其原理是FeSO4與H2O2反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，以羥自由基氧化水楊酸所得產(chǎn)物的吸光值表示羥自由基的多少，吸光值越大，羥自由基越多。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)組樣，即樣品組、對(duì)照組、本底組。樣品組中含有9.0 mmol/L FeSO4，9.0 mmol/L水楊酸鈉，8.8 mmol/L H2O2以及不同質(zhì)量濃度的多糖(0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/ml)各 2 ml，對(duì)照組中用蒸餾水代替多糖，本底組中以蒸餾水代替水楊酸鈉。最后加入H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，37℃水浴1 h，離心后取上清，以蒸餾水調(diào)零，測(cè)波長(zhǎng)510 nm處OD值，吸光值越小，清除效果越好。按下式計(jì)算羥自由基清除率:

式中，E為清除率，A0為標(biāo)準(zhǔn)管 OD值，A為樣品組的 OD值，Ai為本底管OD值。

1.3.3 多糖清除超氧陰離子自由基能力測(cè)定。參照盛偉等的方法［7］，采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定。取50 mmol/L pH 8.2 的 Tris-HCl緩沖液 2.8 ml，分別加入 0.1 ml濃度為 0.5、1.0、2.0、4.0 和8.0 mg/ml的多糖溶液，置于25 ℃水浴鍋中保持10 min，再加入25℃預(yù)溫的60 mmol/L鄰苯三酚0.1 ml，混勻，反應(yīng)3 min后，加入0.05 ml 5%的抗壞血酸以終止反應(yīng)。10 min后，于波長(zhǎng)420 nm處測(cè)吸光度。以等體積10 mmol/L的HCl代替鄰苯三酚溶液作為調(diào)零管，對(duì)照組以等體積純水代替樣品。按下式計(jì)算超氧陰離子自由基清除率:

式中，E為清除率，A0為對(duì)照組OD值，A為樣品組的OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種食用菌子實(shí)體多糖的還原能力 根據(jù)“1.3.1”的測(cè)定方法，在波長(zhǎng)700 nm測(cè)定的吸光值越大，表明樣品的還原能力越強(qiáng)。由圖1可知，在試驗(yàn)所測(cè)定的濃度范圍內(nèi)，多糖的總還原力與濃度呈正相關(guān)性，隨著多糖濃度的增大其還原能力也隨之增強(qiáng)。4種食用菌子實(shí)體多糖還原力大小依次為香菇﹥杏鮑菇﹥茶樹(shù)菇﹥蟹味菇。

圖1 4種食用菌子實(shí)體多糖還原力

2.2 4種食用菌子實(shí)體多糖對(duì)羥自由基的清除作用 亞鐵離子加雙氧水，在紫外光照下可產(chǎn)生羥基自由基，水楊酸法可檢測(cè)羥基及物質(zhì)對(duì)羥自由基的清除能力。在此方法中，羥自由基進(jìn)攻水楊酸分子的苯環(huán)，產(chǎn)生2，3-二羥基苯甲酸，該物質(zhì)可采用分光光度法檢測(cè);由此可測(cè)物質(zhì)清除羥自由基的能力［17］。

由圖2可知，在所選濃度范圍內(nèi)，隨著濃度升高，4種多糖對(duì)羥自由基的清除趨勢(shì)相同，均隨著多糖濃度的增加，羥自由基清除率增大;且在4種多糖中茶樹(shù)菇的羥自由其清除能力最強(qiáng)，其次是香菇，蟹味菇和杏鮑菇對(duì)羥自由基清除能力差異不顯著。

圖2 4種食用菌子實(shí)體多糖對(duì)羥自由基的清除作用

2.3 4種食用菌子實(shí)體多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用 4種食用菌子實(shí)體多糖對(duì)超氧陰離子自由基均有一定的清除作用。由圖3可知，在所選濃度范圍內(nèi)，隨濃度的升高，多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除率呈上升趨勢(shì);其中茶樹(shù)菇和杏鮑菇的清除能力最強(qiáng)，可達(dá)60%以上，蟹味菇對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力最差，僅在10% ～20%內(nèi)。

圖3 4種食用菌子實(shí)體多糖對(duì)超氧陰離子自由基清除作用

3 結(jié)論與討論

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)食用菌多糖的研究及開(kāi)發(fā)利用的報(bào)道較多，且已有多種食用菌產(chǎn)品投入市場(chǎng)，以真菌多糖作為功能性添加劑的保健食品也相繼出現(xiàn)。該研究表明，在所選的4種常用食用菌子實(shí)體多糖中，四者均有一定的抗氧化作用，其中茶樹(shù)菇多糖抗氧化活性遠(yuǎn)高于其他多糖。

香菇、杏鮑菇、蟹味菇、茶樹(shù)菇等食用菌不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，而且含有天然生物活性物質(zhì)，作為食品的功能因子，在醫(yī)藥和保健食品工業(yè)中將具有很好的應(yīng)用前景［18］。該試驗(yàn)結(jié)果表明，上述4種食用菌的多糖都具有較明顯的抗氧化活性，后期研究中可對(duì)抗氧化作用較強(qiáng)的茶樹(shù)菇多糖進(jìn)行分離純化，獲得不同分子組成的多糖體系，并研究多糖的抗氧化機(jī)制，以期為食用菌的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

在4種食用菌子實(shí)體多糖的抗氧化體系中，隨著多糖濃度的升高，多糖抗氧化活性增強(qiáng);4種食用菌子實(shí)體多糖總還原力大小依次為香菇、杏鮑菇、茶樹(shù)菇和蟹味菇;對(duì)羥自由基的清除能力以茶樹(shù)菇最強(qiáng)，其次是香菇，杏鮑菇和蟹味菇的清除能力差異不顯著;對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力仍以茶樹(shù)菇最強(qiáng)，杏鮑菇﹥香菇﹥蟹味菇。

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