樺褐孔菌提取物體外抗氧化活性評(píng)價(jià)研究

馬思慧，程萍，方研，王萍

（東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，哈爾濱 150040）

樺褐孔菌［Inonotusobliques（Fr.）Pilát］是來自西伯利亞原始森林中的藥用真菌，具有預(yù)防心血管疾病、神經(jīng)細(xì)胞衰老、癌癥、糖尿病等疾病的功效［1-5］。這些功能的發(fā)揮與其抗氧化活性密不可分。因此相關(guān)領(lǐng)域的研究主要集中在其抗氧化活性，但對(duì)于其提取物中哪種物質(zhì)的抗氧化性較好鮮有報(bào)道。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)不同溶劑的提取物體外抗氧化活性的評(píng)價(jià)，分析各活性物質(zhì)含量與抗氧化指標(biāo)的相關(guān)性，確定高效抗氧化活性成分，為以后對(duì)樺褐孔菌的進(jìn)一步利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樺褐孔菌，黑龍江省哈爾濱市東北林副特產(chǎn)專營(yíng)店；DPPH，Sigma Aldrich公司；總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（FRAP法），碧云天生物技術(shù)研究所；2-硫代巴比妥酸，上海源葉生物科技有限公司；2-脫氧-D-核糖，上海拜力生物科技有限公司；槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.2 儀器與設(shè)備

722 型可見光分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；JA2003型電子天平 上海良平儀器儀表有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器公司；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；SHB-B循環(huán)水式真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)公司；DG3022型酶標(biāo)儀 華東電子管廠。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

取樺褐孔菌粉碎，過80目篩。裝入密封袋備用。

1.3.2 樺褐孔菌有效成分的提取

分別稱取12份2.0g樺褐孔菌粉末于磨口錐形瓶中，按料液比1∶50分別加入水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、無水乙醇、20%丙酮、40%丙酮、60%丙酮、80%丙酮、100%丙酮和異丙醇，50℃ 水 浴 提 取 2h。3500r／min 離 心 分 離10min，收集上清液。將殘?jiān)凑障嗤姆椒ㄔ偬崛∫淮?。將每次收集的上清液?5℃條件下旋蒸濃縮，冷藏備用。

1.3.3 多糖含量的測(cè)定

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照Dubois，M.，Gilles，KA［6］等人的實(shí)驗(yàn)方法，采用苯酚-硫酸比色法，準(zhǔn)確稱取0.1000g葡萄糖，用蒸餾水定容至1000mL葡萄糖質(zhì)量濃度為0.1g／L密量取該溶液 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分別置于10mL管中，蒸餾水定容至1mL搖勻。再加入5%苯酚試劑0.6mL振蕩，再加入3.6mL迅速振蕩搖勻，于室溫放置30min后在490nm處測(cè)定吸光度。以葡萄糖的濃度（C）W為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程y＝8.8471x-0.0049，相關(guān)系數(shù) R2＝0.9983。

1.3.3.2 多糖含量的測(cè)定［7］

將不同溶劑提取的樺褐孔菌粗提物用蒸餾水定容至100mL分別準(zhǔn)確吸取1mL于25mL管中稀釋成相應(yīng)的倍數(shù)（m）。吸取樣品液1.0mL，置干燥具塞試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制步驟加入苯酚和濃硫酸溶液，測(cè)吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算這1.0mL樣品中多糖含量（f）［8］，用公式計(jì)算多糖含量＝m×f×100

1.3.4 總酚含量的測(cè)定

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［9］

準(zhǔn)確稱取沒食子酸0.025μg，加蒸餾水定容至100mL。精密量取該溶液0.0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70mL，分別置于25mL容量瓶中，用蒸餾水定容。分別加入1mL福林酚試劑，混勻，4min后加入2mL 7.5% 碳酸鈉溶液，45℃水浴15min，于765nm處測(cè)定吸光值。以沒食子酸的濃度（C）W為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程y＝0.0047x＋0.0047，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9961。

1.3.4.2 總酚含量的測(cè)定［10］

將不同溶劑提取的樺褐孔菌粗提物用蒸餾水定容至100mL，分別準(zhǔn)確吸取1mL于25mL試管中稀釋成相應(yīng)的倍數(shù)（m）。吸取樣品液1.0mL，置干燥具塞試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制步驟測(cè)吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算這1.0mL樣品中總酚含量（f），用公式計(jì)算總酚含量＝m×f×100。

1.3.5 黃酮含量的測(cè)定

1.3.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［11］

準(zhǔn)確稱取槲皮素0.002g，加95%乙醇定容至20mL。分別吸取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mL至10mL容量瓶中，用95%乙醇定容。分別轉(zhuǎn)入試管中加2%的氯化鋁2mL，室溫下反應(yīng)30min。于360nm下讀吸光值。以槲皮素的濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程y＝2.1926x-0.0012，相關(guān)系數(shù) R2＝0.9992。

1.3.5.2 黃酮含量的測(cè)定含量測(cè)定［12］

將不同溶劑粗提物用蒸餾水定容至100mL，分別準(zhǔn)確吸取1mL于25mL試管中稀釋成相應(yīng)的倍數(shù)（m）。分別準(zhǔn)確吸取1mL，置干燥具塞試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制步驟加入2%的氯化鋁2mL，95%乙醇定容至10mL，室溫下反應(yīng)30min，于360nm下讀吸光值。以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算這1.0mL樣品中黃酮含量（f）［13］，用公式計(jì)算黃酮含量＝m×f×100。

1.3.6 粗提物抗氧化性的測(cè)定

1.3.6.1 清除 DPPH·能力［14］

準(zhǔn)確稱取6.2mg DPPH，用無水乙醇溶解定容至100mL，各取4mL不同溶劑提取的樣品溶液和該溶劑加入2mL 1×10-4mol／L DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液于比色試管中，迅速混勻，避光反應(yīng)30min后在517nm下測(cè)定吸光度，同時(shí)用水進(jìn)行空白試驗(yàn)。每個(gè)樣品平行進(jìn)行3次，用以下公式計(jì)算清除率（K）［15］。

式中，Ai：4mL樣品溶液＋2mL DPPH溶液的吸光值；Aj：4mL提取溶劑＋2mL DPPH溶液的吸光值；Ac：4mL水＋2mLDPPH溶液的吸光值。

1.3.6.2 總還原力FRAP

標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定的準(zhǔn)備［16］：稱取27.8mg本試劑盒提供的FeSO4·7H2O，溶解并定容到1mL，此時(shí)濃度即為100mmol／L。取適量100mmol／L FeSO4溶液用蒸餾水稀釋至0.15、0.30、0.60、0.90、1.20和1.50mmol／L。

總抗氧化能力的測(cè)定［17］：在96孔板的每個(gè)檢測(cè)孔中加入180μL FRAP工作液。在空白對(duì)照孔中加入5μL蒸餾水；標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)孔內(nèi)加入5μL各種濃度的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液，樣品檢測(cè)孔內(nèi)加入5μL各種樣品，輕輕混勻，于37℃孵育3～5min后測(cè)定593nm處吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS軟件對(duì)粗提物中多糖、總酚、黃酮含量和各抗氧化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

圖1 不同溶劑的多糖含量

2.1 不同溶劑提取物中多糖的含量

圖1可知，樺褐孔菌提取物中多糖含量隨提取溶劑不同而不同。其中，40%乙醇提取物的多糖含量最多，為64.2mg／g；100%丙酮提取物含量最少，為1.87mg／g。不同溶劑提取物物中多糖含量的大小順序?yàn)椋?0%乙醇＞20%乙醇＞60%乙醇＞水＞20%丙酮＞80%乙醇＞60%丙酮＞80%丙酮＞無水乙醇＞異丙醇＞正丁醇＞100%丙酮。

2.2 不同溶劑提取物中總酚的含量

圖2 不同溶劑的多酚含量

由圖2可知，樺褐孔菌提取物中多酚含量隨提取溶劑不同而有所變化。其中，20%丙酮提取物中多酚含量最多，為55.26mg／g；正丁醇提取物中多酚含量最少，為0.95mg／g。按照提取物中多酚含量由多到少的順序排序，為20%丙酮＞60%丙酮＞40%丙酮＞60%乙醇＞40%乙醇＞80%丙酮＞20%乙醇＞80%乙醇＞水＞無水乙醇＞異丙醇＞100%丙酮＞正丁醇。

2.3 不同溶劑提取物中黃酮的含量

由圖3可知，樺褐孔菌提取物中黃酮含量隨提取溶劑不同而有所變化。其中，20%丙酮提取物中黃酮含量最多，為15.12mg／g；正丁醇提取物中黃酮含量最少，為0.067mg／g。按照各溶劑提取物中黃酮含量的多少排序，為20%丙酮＞40%乙醇＞20%乙醇＞60%乙醇＞40%丙酮＞水＞60%丙酮＞80%乙醇＞80%丙酮＞無水乙醇＞丙酮＞異丙醇＞正丁醇。

圖3 不同溶劑的黃酮含量

2.4 不同溶劑提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力

圖4 不同溶劑提取物對(duì)DPPH·的清除能力

DPPH·是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，通過檢測(cè)樺褐孔菌粗提物對(duì)DPPH·的清除能力可以表示其抗氧化性的強(qiáng)弱。由圖4可知，不同溶劑提取物對(duì)DPPH·的清除能力不同。其中，60%乙醇提取物清除率最大，為0.75；正丁醇提取物對(duì)DPPH·的清除能力最小，為0.10。各溶劑對(duì)DPPH·的清除能力大小順序?yàn)椋?0%乙醇＞80%乙醇＞60%丙酮＞20%乙醇＞40%乙醇＞80%丙酮＞水，40%丙酮＞20%丙酮＞無水乙醇＞異丙醇＞100%丙酮＞正丁醇。

2.5 不同溶劑提取物總還原能力的測(cè)定（FRAP法）

圖5 不同溶劑提取物FRAP值

由圖5可知，不同溶劑提取物的FRAP值不同。其中60%乙醇提取物的FRAP值最大，為11.03；異丙醇提取物的FRAP值最小，為1.22。各溶劑提取物的FRAP值大小順序?yàn)椋?0%乙醇＞60%丙酮＞40%乙醇＞40%丙酮＞20%乙醇＞水＞80%丙酮＞20%丙酮＞80%乙醇＞無水乙醇＞丙酮＞正丁醇＞異丙醇。

2.6 相關(guān)性分析結(jié)果

表1 相關(guān)性分析結(jié)果

由表1可知，多糖含量和DPPH·清除率、FRAP值呈顯著性相關(guān)，其相關(guān)性系數(shù)分別為0.851和0.706，均大于多酚含量、黃酮含量與二個(gè)抗氧化指標(biāo)的相關(guān)性系數(shù)。

3 結(jié)論

不同溶劑提取物中多糖含量范圍是1.87～64.2mg／g；多酚含量范圍是0.95～55.26mg／g；，黃酮含量范圍是0.067～15.12mg／g。不同溶劑提取物清除DPPH·的清除率范圍是0.10～0.75，F(xiàn)RAP值的范圍是1.22～11.03。且多糖含量與各抗氧化指標(biāo)的相關(guān)性最大，說明樺褐孔菌多糖在其抗氧化性中發(fā)揮主要作用。本研究對(duì)于開發(fā)具有清除人體自由基的產(chǎn)品具有重要意義。

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