赤桉木質(zhì)素合成途徑OMT基因家族的原核表達(dá)與純化研究

谷振軍，章懷云 ，張黨權(quán)，何含杰 ，陳麗莉，彭 寬 ，陳 容

（1. 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410004；2. 中南林業(yè)科技大學(xué) 林業(yè)生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 湖南省生物發(fā)育工程及新產(chǎn)品研發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410004）

赤桉木質(zhì)素合成途徑OMT基因家族的原核表達(dá)與純化研究

谷振軍1,2，章懷云2，張黨權(quán)1,2，何含杰2，陳麗莉2，彭 寬2，陳 容1,2

（1. 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410004；2. 中南林業(yè)科技大學(xué) 林業(yè)生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 湖南省生物發(fā)育工程及新產(chǎn)品研發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410004）

雙子葉植物的木質(zhì)素主要由愈創(chuàng)木基單體和紫丁香基木質(zhì)素單體聚合形成，這兩種單體的比例對造紙過程中木質(zhì)素去除難易程度具有重要的影響。植物OMT基因家族的CCoAOMT和COMT基因是木質(zhì)素合成途徑的關(guān)鍵酶基因，可調(diào)控植物體內(nèi)木質(zhì)素單體的比例與含量。本文以所克隆的赤桉COMT、CCoAOMT1、CCoAOMT2三個(gè)基因的cDNA為模板，分別構(gòu)建pET-32a的原核表達(dá)質(zhì)粒，并優(yōu)化在大腸桿菌BL21(λDE3)中的表達(dá)體系。結(jié)果顯示，在加入0.4 mmol IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，COMT、CCoAOMT1、CCoAOMT2的原核表達(dá)質(zhì)粒分別在4 h、2 h和3 h后達(dá)到可溶性重組蛋白表達(dá)峰值。通過滲透休克純化方法，可在原核表達(dá)菌株的周質(zhì)空間提純CCoAOMT1和CCoAOMT2重組蛋白，在原核表達(dá)菌株的細(xì)胞質(zhì)中可提純COMT重組蛋白。

赤桉；木質(zhì)素合成；OMT基因家族；原核表達(dá)

桉樹是世界上最重要的制漿造紙?jiān)牧蟍1]，在我國已有一百多年的歷史，是我國南方熱帶、亞熱帶地區(qū)最為重要的速生人工造林樹種，在我國造紙產(chǎn)業(yè)中有著極其重要的地位。近年來，桉樹木材又被開發(fā)成生物柴油[2]，使得桉樹有成為新型生物質(zhì)能源樹種的巨大潛力。木質(zhì)素是一種具有三維立體結(jié)構(gòu)的天然高分子聚合物，廣泛存在于高等植物的維管束中，是木質(zhì)部細(xì)胞壁的主要成分之一[3]。在木材細(xì)胞壁中，木質(zhì)素作為一種填充和粘合物質(zhì)，以物理或化學(xué)的方式與纖維素和半纖維素相互之間緊密粘合在一起[4]，而在制漿造紙工業(yè)中，需要將木質(zhì)素從纖維素和半纖維素中去除，從而產(chǎn)生大量的造紙廢液，嚴(yán)重污染環(huán)境。因此，去除木質(zhì)素已成為制漿造紙工業(yè)污染的主要源頭物質(zhì)[5]。木質(zhì)素含量降低除了能夠減少造紙工業(yè)藥品和能量的消耗，也能明顯提高紙張的白度和顏色穩(wěn)定性[6]。不同類型植物的木質(zhì)素單體組成明顯不同，裸子植物主要為愈創(chuàng)木基木質(zhì)素（G木質(zhì)素），雙子葉植物主要含愈創(chuàng)木基-紫丁香基木質(zhì)素（G-S木質(zhì)素），單子葉植物則為愈創(chuàng)木基-紫丁香基-對-羥基苯基木質(zhì)素（G-S-H木質(zhì)素）[7]。木質(zhì)素三種單體的比例對造紙過程中木質(zhì)素去除難易程度和飼料中可消化性都具有重要影響[8]。

氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶基因家族（O-Methyltransferase, OMT）通常作用于植物體內(nèi)木質(zhì)素生物合成、類黃酮生物合成、生物堿生物合成等次生代謝途徑中一些小分子的甲基化[9-10]，而這種甲基化則決定了這些小分子在植物體內(nèi)生理功能的特異性[11]。COMT（咖啡酰O-甲基轉(zhuǎn)移酶）和CCoAOMT（咖啡酯乙酰輔酶A氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶）是OMT基因家族中控制植物次生細(xì)胞壁中的木質(zhì)素含量和組分的關(guān)鍵基因，對木材結(jié)構(gòu)和強(qiáng)度等特性有密切關(guān)系[12]，能夠控制木質(zhì)素G、S、H三種單體的比例和含量[13]，是決定木質(zhì)素單體組分比例和木質(zhì)素去除難易程度的關(guān)鍵基因[14]。通過在大腸桿菌等原核生物中表達(dá)目標(biāo)基因的核苷酸序列片段，翻譯合成異源目的蛋白，可以方便快捷地研究目標(biāo)蛋白的功能特征和酶學(xué)特性[11]。本研究通過融合（硫氧化還原蛋白A，trxA）原核表達(dá)方式，對赤桉COMT、CCoAOMT1、CCoAOMT2三個(gè)基因進(jìn)行高效表達(dá)與純化，為進(jìn)一步研究這三個(gè)蛋白的功能和酶學(xué)活性提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)已克隆的赤桉COMT基因(GU109375)、CCoAOMT1基 因 (GQ889423)、CCoAOMT2基因(GQ889422)，設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增引物，擴(kuò)增目的基因的CDS（coding sequence）序列。在COMT基因擴(kuò)增正向引物和反向引物分別引入EcoRI和HindⅢ酶切位點(diǎn)，CCoAOMT1和CCoAOMT2基因擴(kuò)增正、反引物則分別引入EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)，用于插入至pET-32a原核表達(dá)載體中（表1，其中下劃線表示酶切位點(diǎn)）。

1.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

用含有目的基因全長cDNA片段的三個(gè)質(zhì)粒DNA為模板，進(jìn)行目的基因CDS序列的PCR擴(kuò)增。使用PCR引物（表1）和Takara Pyrobest酶進(jìn)行擴(kuò)增，PCR程序?yàn)椋侯A(yù)變性(94℃/5 min)；變性(94℃/40 s)、退火(45 s)、延伸(72℃/120 s)，35個(gè)溫度循環(huán)；總延伸(72℃/8 min)。COMT、CCoAOMT1、CCoAOMT2的退火溫度分別為60℃、62℃、58℃。純化回收目的產(chǎn)物，雙酶切后，與經(jīng)相同雙酶切的載體pET-32a進(jìn)行體外連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，構(gòu)建出最終的原核表達(dá)質(zhì)粒。

表1 原核表達(dá)載體構(gòu)建的引物Table 1 Primers used for prokaryotic expression vector

1.3 原核表達(dá)體系的優(yōu)化

將三個(gè)表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（λDE3），接入5 mL含Amp抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.4，再按1∶100比例稀釋接種至新鮮的50 mL LB培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)0.6，加入100 mmol的IPTG貯藏液至終濃度為0.4 mmol，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。在加入ITPG后的2 h、3 h和4 h，分別取5 mL菌液離心收集菌體。用500 μL的PBS緩沖液重懸菌體進(jìn)行超聲波破碎，離心分離出的上清液即為菌體的可溶性蛋白質(zhì)。

1.4 重組蛋白的純化

（1）原核表達(dá)體系的放大培養(yǎng)。按照已優(yōu)化的原核表達(dá)體系，放大成500 mL的培養(yǎng)體系，用于提取并純化目的蛋白。為獲得良好的通氣，培養(yǎng)基體積不超過搖瓶容量的20%。

（2）滲透休克法提純目的蛋白。將搖瓶置于冰上5分鐘，于5 000 g條件下4℃離心5 min收集菌體。再用適量預(yù)冷（約100 mL）的高滲透壓溶液（80%蔗糖，2.5 mmol EDTA，20 mmol Tris-HCl (pH 8.0)）重懸菌體，使菌體濃度達(dá)到OD550值等于5單位/mL，冰浴靜置10 min；于15 000 g條件下離心30秒，去除上清后再重懸于同體積的低滲透壓溶液（2.5 mmol EDTA，20 mmol Tris-HCl (pH 8.0)），冰浴靜置10 min；于15 000 g條件下4℃離心10 min，收集含有目的蛋白的上清液。

（3）從細(xì)胞質(zhì)中提純可溶性蛋白。將搖瓶置于冰上5 min，于5 000 g條件下4℃離心5 min收集菌體，重懸于100 mL PBS緩沖液中。使用超聲波破碎儀在冰上破碎細(xì)胞，與14 000 g條件下4℃離心10 min，收集含有可溶性重組蛋白的上清液。

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

赤桉COMT通過EcoRI/ HindⅢ雙酶切，CCoAOMT1、CCoAOMT2通過EcoRI/ XhoI雙酶切，分別將三個(gè)目的基因的CDS插入至pET-32a的多克隆位點(diǎn)中，實(shí)現(xiàn)與trxA基因的融合表達(dá)。pET32a-COMT原核表達(dá)質(zhì)粒的EcoRI/ HindⅢ雙酶切結(jié)果顯示，有兩條長度分別為1098 bp和5900 bp的條帶，長度較小的條帶與赤桉COMT的CDS序列大小一致；pET32a-CCoAOMT1、pET32a-CCoAOMT2原核表達(dá)質(zhì)粒的EcoRI/ XhoI雙酶切結(jié)果與預(yù)期一致，分別酶切產(chǎn)生5900 bp的載體片段，696 bp的CCoAOMT1的CDS片段，和741 bp的CCoAOMT2的CDS片段，表明三個(gè)目的基因CDS插入片段大小正確（圖1）。將構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行DNA雙向測序，表明所獲得的三個(gè)目的基因原核表達(dá)質(zhì)粒序列未發(fā)生變化。

圖1 三個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.1 Double digestion D pattern of three constructed expression plasmids

2.2 原核表達(dá)體系的優(yōu)化

采用SDS-PAGE電泳方法，分析原核表達(dá)菌株在加入IPTG后不同誘導(dǎo)時(shí)間條件下的可溶性重組蛋白表達(dá)變化情況，分別優(yōu)化這個(gè)三個(gè)原核表達(dá)體系。結(jié)果顯示（圖2），赤桉COMT蛋白與TrxA標(biāo)簽蛋白融合形成58.49 kDa的融合蛋白，產(chǎn)物符合預(yù)期大小，在加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h后的可溶性COMT蛋白表達(dá)量最大；CCoAOMT1、CCoAOMT2的融合蛋白大小分別為44.57 kDa、46.34 kDa，分別在加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)2 h后、3 h后的可溶性蛋白表達(dá)量最大。

圖2 大腸桿菌中不同時(shí)間誘導(dǎo)表達(dá)后的可溶性重組蛋白表達(dá)變化分析Fig.2 Analysis of recombinant soluble proteins expressed in proteins of E.coli by different induction time

2.3 重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物的純化

本文使用LaVallie報(bào)道[15]的滲透休克提取法，在4℃溫度下將大腸桿菌先后懸浮于高滲透壓與低滲透壓的溶液中，利用滲透震蕩作用（osmotic shock）可將細(xì)胞質(zhì)中的可溶性TrxA-目的蛋白的重組融合蛋白釋放細(xì)胞外，用于提純目的蛋白。

Tricine-SDS-PAGE分析結(jié)構(gòu)表明，對表達(dá)的赤桉COMT重組融合蛋白使用滲透休克作用后，只有少量的融合蛋白被釋放到滲透休克組分中，絕大部分保留在細(xì)胞質(zhì)可溶部分中，還有一部分融合蛋白以不溶解的包涵體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中；而赤桉CCoAOMT1和CCoAOMT2的重組融合蛋白則主要存在于滲透休克組分中（圖3）。因此，赤桉COMT重組融合蛋白可在加入ITPG誘導(dǎo)4 h后直接從細(xì)胞質(zhì)的可溶部分中提取，而赤桉CCoAOMT1和CCoAOMT2的重組融合蛋白可在加入ITPG誘導(dǎo)2 h后通過滲透休克作用進(jìn)行提取。

圖3 電泳分析目的蛋白的表達(dá)定位分析Fig.3 Tricine-SDS-PAGE analysis of target protein’s location in E.coli BL21(λDE3)

3 結(jié)論與討論

不同物種的OMT基因家族成員差別較大，涉及到多個(gè)此生代謝物質(zhì)合成途徑[9]。OMT基因家族所屬的甲基化酶超基因家族（包含OMT、SMT（S-methyltransferase）等多個(gè)基因家族）則更加復(fù)雜龐大，通過序列相似性法則歸類各個(gè)成員之間的關(guān)系時(shí)，易發(fā)生與酶學(xué)特性的不一致[16-17]，如通過序列比較認(rèn)為是長春花OMT的一個(gè)基因，酶學(xué)實(shí)驗(yàn)則表明是SMT基因家族成員[17]。隨著更多蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)被測定，有利于從高級結(jié)構(gòu)水平上理解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與其功能的關(guān)系。通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模擬技術(shù)，可在三維結(jié)構(gòu)水平上進(jìn)行OMT家族成員的分類。在植物木質(zhì)素合成途徑中，OMT基因家族主要成員為COMT和CCoAOMT，作用于木質(zhì)素合成途徑中的底物包括：5-Hydroxy Coniferaldehyde（5-羥基松柏醛）、5-Hydroxyconiferyl Alcohol（5-羥基松柏醇）和Caffeoyl Coenzyme A（咖啡酯乙酰輔酶A）等[9,18]。本研究所克隆的赤桉CCoAOMT為2個(gè)成員的小型亞基因家族。

通過在大腸桿菌等原核生物中表達(dá)目的基因的重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物，是研究目標(biāo)蛋白的功能特征和酶學(xué)特性的基礎(chǔ)。本研究通過構(gòu)建基于pET-32a的CCoAOMT1、CCoAOMT2、COMT的原核重組表達(dá)質(zhì)粒，并實(shí)現(xiàn)了該三個(gè)重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21(DE3)中的高效表達(dá)。通過分析大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)蛋白組分和不同IPTG誘導(dǎo)時(shí)間對重組蛋白表達(dá)量的影響，表明赤桉CCoAOMT1和CCoAOMT2重組融合蛋白可在加入ITPG誘導(dǎo)2 h后通過滲透休克作用提取和純化，而赤桉COMT重組融合蛋白可在加入ITPG誘導(dǎo)4 h后提取細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行純化，最后利用pET-32a上攜帶的硫氧化還原蛋白A標(biāo)簽，初步提純了重組融合蛋白。本文結(jié)果為研究赤桉OMT基因家族中CCoAOMT和COMT的蛋白質(zhì)底物催化活性提供了基礎(chǔ)。

[1] 劉 果, 張黨權(quán), 謝耀堅(jiān), 等. 桉樹Genomic-SSR和EST-SSR引物的快速篩選與通用性研究[J].林業(yè)科學(xué),2013,(2):127-133.

[2] Tarabet, L., K. Loubar, M.S. Lounici, et al. Eucalyptus biodiesel as an alternative to diesel fuel: preparation and tests on DI diesel engine[J].Journal of biomedicine & biotechnology, 2012. 2012: 235485.

[3] Schuetz M, R Smith, B Ellis. Xylem tissue specification,patterning, and differentiation mechanisms[J]. J Exp Bot, 2013.64(1): 11-31.

[4] Li, X. and C. Chapple. Understanding Lignif i cation: Challenges Beyond Monolignol Biosynthesis[J]. Plant Physiology, 2011.154(5): 449-452.

[5] Baucher, M., C. Halpin, M. Petit-Conil, et al. Lignin:Genetic Engnieering and Impact on Pulping[J]. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 2003(38): 305-350.

[6] 張利萍, 高 慧, 牛 敏. 歐美楊107的制漿性能[J]. 經(jīng)濟(jì)林研究, 2009, 27(1): 80-84.

[7] Nunes C A, C F Lima, L C Barbosa, et al. Determination of Eucalyptus spp lignin S/G ratio: a comparison between methods[J]. Bioresour Technol, 2010. 101(11): 4056-61.

[8] 李潞濱, 劉 蕾, 何聰芬, 等. 木質(zhì)素生物合成關(guān)鍵酶基因的研究進(jìn)展[J]. 分子植物育種, 2007,(S1): 45-51.

[9] Lam K C, R K Ibrahim, B Behdad, et al. Structure, function,and evolution of plant O-methyltransferases[J]. Genome, 2007.50(11): 1001-1013.

[10] 郭 昭, 趙一玲, 劉景利, 等. 木質(zhì)素合成酶咖啡酸3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)的遺傳調(diào)控研究[J]. 分子植物育種, 2006,(S2): 122-126.

[11] Bassard J E, L Richert, J Geerinck, et al. Protein-protein and protein-membrane associations in the lignin pathway[J]. Plant Cell, 2012. 24(11): 4465-82.

[12] Vanholme R, B Demedts, K Morreel, et al. Lignin biosynthesis and structure[J]. Plant Physiol, 2010. 153(3): 895-905.

[13] 谷振軍, 張黨權(quán), 黃青云. 木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶基因與造紙植物轉(zhuǎn)基因改良應(yīng)用研究[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2010,30(3): 67-74.

[14] Vanholme, R., V. Storme, B. Vanholme, et al. A systems biology view of responses to lignin biosynthesis perturbations in Arabidopsis[J]. Plant Cell, 2012. 24(9): 3506-29.

[15] LaVallie E R, E A DiBlasio, S Kovacic, et al. A Thioredoxin Gene Fusion Expression System That Circumvents Inclusion Body Formation in the E. coli Cytoplasm[J]. Nat Biotech, 1993.11(2): 187-193.

[16] Deavours, B., C.-J. Liu, M. Naoumkina, et al. Functional analysis of members of the isoflavone and isoflavanone O-methyltransferase enzyme families from the model legume Medicago truncatula[J]. Plant Molecular Biology, 2006. 62(4):715-733.

[17] Coiner, H., G. Schrder, E. Wehinger, et al. Methylation of sulfhydryl groups: a new function for a family of small molecule plant O-methyltransferases[J]. Plant Journal, 2006. 46(2): 193-205.

[18] Day, A., G. Neutelings, F. Nolin, et al. Caffeoyl coenzyme A O-methyltransferase down-regulation is associated with modifications in lignin and cell-wall architecture in flax secondary xylem[J]. Plant Physiology and Biochemistry, 2009.47(1): 9-19.

[19] 廖 立, 涂登云, 李重根, 等. 熱處理對尾赤桉木材物理力學(xué)性能的影響[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2013,33(5):128-131.

Prokaryotic expression and purif i cation of OMT family genes involved in lignin niosynthesis of Eucalyptus camaldulensis

GU Zhen-jun1,2, ZHANG Huai-yun2, ZHANG Dang-quan1,2, HE Han-jie2, CHEN Li-li2, PENG Kuan2, CHEN Rong1,2
(1. Key Laboratory of Cultivation and Protection for Non-Wood Forest Trees, Ministry of Education, Changsha 410004, Hunan, China;2. Hunan Provincial Key Laboratory of Forestry Biotechnology / Cooperative Innovation Center of Engineering and New Products for Developmental Biology of Hunan Province, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

∶ In dicotyledons, the lignin polymer is constructed by the guaiacyl and syringyl units, and the ratio of this two units decide the wood characteristics and the pulping performance. The CCoAOMT and COMT gene of OMT gene family plays a key role in the lignin biosynthesis, with a function to determine the contents of lignin and the ratio of monolignol. In this study, three target cDNAs (COMT,CCoAOMT1, CCoAOMT2) of Eucalyptus camaldulensis were inserted into the prokaryotic expression vector pET-32a, and constructed plasmids were transformed into E. coli BL21 (λDE3). The expression condition was optimized. The analysis result showed that the optimal induction time after 0.4 mmol ITPG been added for COMT, CCoAOMT1 and CCoAOMT2 expression is 4 hours, 2 hours and 3 hours, respectively. The CCoAOMT1 and CCoAOMT2 recombinant protein can be purif i ed by the osmotic shock-mediated method, and soluble COMT recombinant protein can be purif i ed from the cytoplasm of E. coli..

∶ Eucalyptus camaldulensis; lignin biosynthesis; OMT gene family; Prokaryotic expression

S781.29

A

1673-923X(2014)06-0024-04

2014-01-14

湖南省研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（CX2013B360）；中南林業(yè)科技大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（CX2013A02）

谷振軍（1985-），男，湖南株洲人，博士研究生

張黨權(quán)（1976-），男，江西撫州人，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹参锓肿由飳W(xué)與林產(chǎn)品加工利用；

E-mail：zhangdangquan@163.com

[本校編校：吳 彬]