牡丹籽油體外及對脂代謝紊亂大鼠體內(nèi)抗氧化作用的研究

劉叢彬 宣自華 董振興,2 彭代銀

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥安徽省工程技術(shù)研究中心 省部共建新安醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室1，合肥 230038)(洛陽花瓣舞生物技術(shù)有限公司2，洛陽 471000)

牡丹籽油體外及對脂代謝紊亂大鼠體內(nèi)抗氧化作用的研究

劉叢彬1宣自華1董振興1,2彭代銀1

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥安徽省工程技術(shù)研究中心 省部共建新安醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室1，合肥 230038)(洛陽花瓣舞生物技術(shù)有限公司2，洛陽 471000)

研究牡丹籽油的體外自由基清除率及對脂代謝紊亂大鼠體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的酶比活力及丙二醛(MDA)含量的影響。采用α，α-二苯-β-苦味肼(DPPH·)法、[2，2-連氮-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽](ABTS)法計算自由基清除率(Inhibition percent, IP)；比色法測定脂代謝紊亂大鼠肝組織及血清SOD、GSH-Px酶比活力及MDA含量。牡丹籽油清除自由基能力與其濃度呈明顯的量效(正比)關(guān)系。與模型對照組比較，中、高劑量組SOD、GSH-Px酶比活力顯著提高，MDA含量降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明牡丹籽油具有明顯的體內(nèi)外抗氧化作用。

牡丹籽油 自由基清除率 超氧化物歧化酶 谷胱甘肽過氧化物酶 丙二醛

牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)是毛茛科芍藥屬灌木，在我國各地廣泛種植。自古以來皆用其根皮入藥，名曰“丹皮”[1]。牡丹籽油系從牡丹籽仁提取的的金黃色透明油狀液體，不飽和脂肪酸含量高達90%，其中亞麻酸占66.85%，亞油酸占23.34%及多種人體必須的活性成分[2-4]，具有降血脂、降膽固醇和促進脂肪代謝、增強免疫、預(yù)防冠心病等生理活性[5]，其現(xiàn)已列為我國新資源食品[6]。

近年來，牡丹籽油提取和開發(fā)的研究有大幅增加[5-8], 但對其功效學(xué)方面的研究鮮有報道，缺少試驗數(shù)據(jù)。本試驗所用牡丹籽油系通過牡丹籽脫殼后壓榨，再經(jīng)精煉而成。試驗就牡丹籽油體內(nèi)外抗氧化的功效學(xué)進行探索研究，為牡丹籽油可能作為心血管疾病的預(yù)防使用、輔助治療及其食品安全性提供理論依據(jù)，在其開發(fā)應(yīng)用方面提供參考。

1 材料

1.1 藥物與試劑

牡丹籽油:洛陽花瓣舞生物技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒：南京建成生物工程研究所，批號:20121210；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)試劑盒：南京建成生物工程研究所，批號：20121227；正己烷：上海潤捷化學(xué)試劑有限公司，批號：20120730；過硫酸鉀：國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20120824。

1.2 實驗動物

SPF級SD大鼠，雄性，8周齡，體質(zhì)量(200±20) g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物飼養(yǎng)許可證號：皖動準(zhǔn)字號SCXK2011-002；試驗動物合格證號：No.3400020000136。本試驗方案及實驗動物的飼養(yǎng)與使用處置均通過安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會審批，并嚴格遵從委員會有關(guān)實驗動物倫理關(guān)懷和規(guī)范進行。

1.3 儀器

GL20A全自動高速冷凍離心機：湖南儀器儀表總廠；FSH-2型可調(diào)高速勻漿器：江蘇省金壇市容體儀器制造有限公司；UV-1600型紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；MK3型酶標(biāo)儀：美國賽默飛世爾公司。

2 試驗方法

2.1 清除DPPH·法

分別取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL牡丹籽油于10 mL容量瓶中，用正己烷定容后混勻。再分別取1.0 mL至10 mL容量瓶中，用無水乙醇定容，即得到牡丹籽油的系列濃度0.001、0.002、0.004、0.008、0.010 mL/mL；稱取23.66 mg DPPH·用甲醇溶解并稀釋至10 mL容量瓶中[9-11]，搖勻，作為儲備液(6 mmol/L)，低溫避光保存。用時取0.5 mL儲備液置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成0.12 mmol/L的DPPH·溶液。樣品加入比色皿中于517 nm處進行吸光度的測定，重復(fù)3次，取平均值。

2.2 清除ABTS+·法

取 25 mL 的7 mmol/L ABTS 溶液[9-10,12]和440 μL的140 mmol/L 過硫酸鉀溶液混合，在室溫下暗處反應(yīng) 12～16 h 形成ABTS自由基陽離子儲備液。低溫避光保存。使用前用無水乙醇稀釋制成工作液，在 734 nm 處的吸光值為 0.7±0.02。自由基工作液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。樣品加入比色皿中于734 nm處進行吸光度的測定，重復(fù)3次，取平均值。

2.3 體內(nèi)抗氧化試驗方法

2.3.1 動物分組與給受試物方法

SD雄性大鼠60只，適應(yīng)4 d后隨機分成5組[9]，每組12只，即空白對照組(給予蒸餾水)、高脂飼料對照組(模型組)、高脂飼料+牡丹籽油高、中、低劑量(6.0、3.0、1.5 g/kg)組，每組10只。其中以人體推薦量[≤10 g/(d·人)]的5倍設(shè)定高劑量組牡丹籽油給受試物量。

高脂飼料由93.8%基礎(chǔ)飼料、1%膽固醇、5%豬油、0.2%膽鹽組成。給予高脂飼料的同時進行給受試物，給受試物體積為10 mL/kg，連續(xù)30 d，每天1次。每周稱重1次，以調(diào)整給受試物量?？瞻?、模型組大鼠給以等量的蒸餾水。

2.3.2檢測指標(biāo)與方法

末次給受試物結(jié)束后，3.5%水和氯醛腹腔注射大鼠麻醉，腹主動脈取血，4 ℃離心，4 000 r/min，10 min，取血清，置-20 ℃冰箱保存。取血后的大鼠頸椎脫臼處死，取肝臟，稱重。將稱重后的肝臟置于勻漿器中，加入冰生理鹽水，研磨勻漿，靜置，4 ℃離心，4 000 r/min，10 min,取上清液，制備10%的肝組織生理鹽水勻漿，置-20 ℃冰箱保存，按試劑盒操作分別測定SOD、GSH-Px酶比活力及MDA的含量。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

3 試驗結(jié)果

3.1 體外抗氧化自由基清除率

采用體外清除DPPH·、ABTS+·體外抗氧化活性檢測不同濃度牡丹籽油自由基清除率，隨著牡丹籽油劑量的增大, 其自由基清除率也愈大, 表明清除自由基能力與濃度呈明顯的量效關(guān)系，見表1。

表1 不同濃度牡丹籽油自由基清除率DPPH·及ABTS+·法檢測結(jié)果

由表1可見，不同濃度樣品對DPPH·與ABTS+·的測定結(jié)果與趨勢均無顯著性差異。

3.2 牡丹籽油對脂代謝紊亂大鼠血清、肝組織中SOD、GSH-Px水平的影響

與模型對照組相比，高、中、低劑量組大鼠肝組織中SOD、GSH-Px酶比活力明顯提高(P<0.05；P<0.01)；與模型對照組相比，高、中劑量組大鼠血清中SOD、GSH-Px酶比活力明顯提高；各給受試物組與空白對照組相比，SOD、GSH-Px酶比活力均無明顯差異(P>0.05)，具有統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

表2 牡丹籽油對脂代謝紊亂大鼠肝組織、血清中SOD、GSH-Px酶比活力的影響

注：*P<0.05；**P<0.01,下同。

3.3 牡丹籽油對脂代謝紊亂大鼠血清、肝組織中MDA含量的影響

由表3可見，與模型對照組相比，高、中、低劑量組大鼠肝組織、血清中MDA含量明顯降低(P<0.05；P<0.01)；各給受試物組與空白對照組相比，MDA含量差異無顯著性(P>0.05)，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 牡丹籽油對脂代謝紊亂大鼠MDA含量的影響

4 討論與結(jié)論

牡丹籽油的主要成分是亞油酸、油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸，其中亞油酸、亞麻酸是人體必需脂肪酸，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有多個不飽和化學(xué)鍵，在體外具有捕捉自由基的能力，結(jié)合氧化物成分，具有抗氧效果，在動物體內(nèi)能促進膽固醇代謝，清除血管壁上的沉積物，對抗脂質(zhì)代謝紊亂。研究發(fā)現(xiàn)，膽固醇必須與亞油酸結(jié)合后，才能在體內(nèi)進行正常的運轉(zhuǎn)和代謝。

通過體外自由基清除率試驗表明，清除DPPH·測定結(jié)果與ABTS+·測定結(jié)果是一致的，且隨著濃度的升高自由基清除率越高，也提示牡丹籽油具有一定的體外抗氧化能力；通過體內(nèi)對脂代謝紊亂大鼠血清、肝組織中SOD、GSH-Px水平及MDA含量的測定，中、高劑量組與模型對照組相比SOD、GSH-Px酶比活力顯著提高，MDA含量降低，且有顯著性差異，進一步提示牡丹籽油具有體內(nèi)的抗氧化能力。

高脂飲食可導(dǎo)致體內(nèi)脂代謝紊亂，機體抗氧化能力下降，產(chǎn)生氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激使體內(nèi)或細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與抗氧化之間失衡，從而導(dǎo)致組織的損傷。高脂介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化可產(chǎn)生大量自由基，攻擊血漿游離脂肪酸中的不飽和脂肪酸，導(dǎo)致清除自由基能力減弱。過剩的自由基攻擊生物膜系統(tǒng)中多不飽和脂肪酸、DNA、蛋白質(zhì)和其他生物大分子，在不飽和鍵上不斷產(chǎn)生快速的脂質(zhì)過氧化作用，從而促進代謝性疾病的發(fā)生[13]。本試驗結(jié)果說明牡丹籽油可以有效清除過量的自由基，對機體起到抗氧化作用。

自由基是生物體中生化反應(yīng)的普遍中間介質(zhì)或稱非特異性調(diào)節(jié)劑。在正常生理情況下，活性氧的產(chǎn)生與清除可維持在一個有利無害的極低水平，但在衰老、應(yīng)激、疾病情況下發(fā)生活性氧對重要生物分子的損傷，引起組織損害和器官退行性變化[14]。機體抗氧化防御體系中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和總抗氧化能力(T-AOC)對氧化與抗氧化平衡起著重要作用，可以有效阻斷自由基引起的連鎖反應(yīng)，從而起到抗氧化、抗衰老作用[15]。因此，牡丹籽油作為具有清除自由基效能的外源性抗氧化劑，日益受到重視。

隨著人們綠色環(huán)保消費意識增強以及化學(xué)合成抗氧劑毒害作用的發(fā)現(xiàn)，尋找并研究具有抗氧化活性的天然成分日益成為熱點[16]。牡丹籽油較其他植物油脂具有更多營養(yǎng)成分和特性，具有降低膽固醇，調(diào)節(jié)血脂以及天然抗氧化功能，已逐漸被人們關(guān)注，被應(yīng)用于食品、保健、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域[7]。

[1]中華人民共和國藥典(2010一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社：160-161

[2]王昌濤,張萍,董銀卯. 超臨界CO2提取牡丹籽油的工藝以及成分分析[J].中國糧油學(xué)報，2009，24(8)：96-99

[3]周海梅,馬錦琦,苗春雨,等. 牡丹籽油的理化指標(biāo)和脂肪酸成分分析[J].中國油脂，2009,34(7)：72-74

[4]劉建華,程傳格,王曉,等. 牡丹籽油中脂肪酸的組成分析[J].化學(xué)分析計量，2006,15(6)：30-31

[5]王偉偉. 牡丹籽油中脂肪酸的構(gòu)成及生理功能[J].中國衛(wèi)生產(chǎn)業(yè)，2011,8(12)：8-9

[6]雷克鴻. 衛(wèi)生部批準(zhǔn)元寶楓籽油和牡丹籽油為新資源食品[N].中國食品報，2011-06-06

[7]李凱,周寧,李赫宇. 牡丹花、牡丹籽成分與功能研究進展[J].食品研究與開發(fā)，2012,33(3)：228-231

[8]朱文學(xué),李欣,劉少陽, 等. 牡丹籽油的毒理學(xué)研究[J].食品科學(xué)，2010,31(11)：248-252

[9]徐淑云.藥理實驗方法學(xué)[M].(第3版).北京:人民衛(wèi)生出版社：427-437，1472

[10]邱金東,湯昆. DPPH和ABTS法測定核桃仁的體外抗氧化活性[J].中成藥，2008,30(8)：1215-1216

[11]Chen Y, Wang M F, Rosen R T, et al. 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl radical scavenging active components from polygonummulti orum Thunb[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1999, 47(6):2226-2228

[12]Lee I K, Yun B S. Hispidin analogs from themushroom Inonotus xeranticus and their free radical scavenging activity[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,2006,16:2376-2379

[13]周思宇,翟成凱,姜明霞,等. 復(fù)合全谷豆粗雜糧對脂代謝紊亂大鼠體內(nèi)外抗氧化作用的影響[J].衛(wèi)生研究，2013,42(1)：1-5

[14]Chatgilialoglu C, Ferreri C, Masi A, et al. Free radicals_in chemical biology: from chemical behavior to biomarker development[J]. Journal of Visualized Experiments, 2013, 15(4):74

[15]Sugamura Koichi,Keaney John F Jr.Reactive oxygen species in cardiovascular disease[J].Free Radical Biology and Medicine,2011,51(5):978-992

[16]趙建,宋亮楠,劉薇,等. ORAC法測定保健食品抗氧化能力的體內(nèi)外實驗對比分析[J].食品科學(xué)，2011,32(15)：103-108.

Antioxidation of Peony Seed Oil in Vitro and The Disorder of Lipid Metabolism in Rats

Liu Congbin1Xuan Zihua1Dong Zhenxing1,2Peng Daiyin1
(Anhui University of Chinese Medicine, Project Technology Research Center in Anhui Province for Modern TCM, Key Laboratory of Xin'an Medicine, Ministry of Education1,Hefei 230038)(Luoyang Petals Dance Biotechnology Co.Ltd.2,Luoyang 471000)

To study the pharmacodynamics function of Peony seed oil on the clearance rate of free radicals in vivo and the influence on superoxide dismutase (SOD), glutathione-peroxidase (GSH-px) activity and malondialdehyde (MDA) content in vitro of the disorder of lipid metabolism in rats. Methods calculate the inhibition percent (IP) of free radical with DPPH and ABTS methods. Detected SOD, GSH-Px specific activity and MDA content in liver homogenate and serum by colorimetric method. Results with the peony seed oil, the free radical-scavenging rose in a dose-dependent manner. Compared with those of the blank control group ,SOD,GSH-Px specific activity of medium and high dose groups were markedly enhanced while the content of MDA were reduced significantly and the differences had statistical significance (P<0.05) . In conclusion, there is an antioxidative effect of peony seed oil in vitro and vivo obviously.

peony seed oil, clearance rate of free radicals,SOD, GSH-Px, MDA

TQ432.2

A

1003-0174(2014)06-0053-04

2013-07-05

劉叢彬，男，1975年出生，講師，中藥及復(fù)方的藥理藥效

彭代銀，男，1963年出生，教授，中藥及復(fù)方的藥理藥效