微衛(wèi)星DNA在分析核桃遺傳多樣性上的應用

肖志娟，翟梅枝，王振元，許 靜，李 麗，楊 惠

(西北農林科技大學 林學院,陜西 楊凌 712100)

微衛(wèi)星DNA在分析核桃遺傳多樣性上的應用

肖志娟，翟梅枝，王振元，許 靜，李 麗，楊 惠

(西北農林科技大學 林學院,陜西 楊凌 712100)

研究不同核桃品種的遺傳多樣性，為今后新品種的培育和種質創(chuàng)新提供理論依據，以西北農林科技大學資源苗圃的18個核桃品種（包括3個實生優(yōu)系）嫩葉做材料，選用SSR分子標記技術對其進行了遺傳多樣性研究。建立了最適PCR反應體系，從27對引物中篩選出多態(tài)性強重復性好的12對引物，共檢測出174條條帶，其中91條呈現多態(tài)性，多態(tài)性條帶的比例平均為67.82%，平均每條引物擴增出多態(tài)性位點9.8個。新疆2號與遼寧4號的相似系數最大（0.803 6），青林和西林2號最?。?.159 4）。多態(tài)信息含量（PIC）變化范圍在0.742 2～0.896 2，平均值為0.815 0，其值均大于0.500 0?；谶z傳相似性系數的UPGMA聚類結果表明，在遺傳相似系數閾值為0.39左右可將供試品種分成4大類。以上說明12條引物擴增的位點均表現出高度多態(tài)，同時表明供試樣品遺傳資源非常豐富，可作為育種來源。

核桃；SSR分子標記技術；體系優(yōu)化；遺傳多樣性

核桃屬Juglans植物約有20多種,而核桃是中國栽培范圍最廣的種，也是我國分布廣泛，栽培歷史悠久的重要經濟樹種, 在國際市場上與扁桃、腰果、榛子一起并列為世界四大干果[1]，其種仁除含蛋白質、碳水化合物、脂肪外，還含胡蘿卜素、硫胺素、核黃素、鈣、磷、鐵和尼克酸等多種成分[2]，具有很高的藥用價值、經濟價值和營養(yǎng)價值。

核桃種質資源極為豐富,在抗性、豐產性及果實品質和形態(tài)特征等方面都存在顯著差異，具有豐富的遺傳多樣性[3]。由于核桃品種眾多，在地形、氣候條件等不同生態(tài)環(huán)境條件下, 經長期的異花授粉、自然選擇和人工雜交，導致其遺傳背景非常復雜。核桃遺傳多樣性研究是核桃種質資源保護及開發(fā)利用的基礎，開展核桃種質資源遺傳多樣性評價對研究核桃的起源、演化具有重要意義。

準確認識核桃種質資源的親緣關系及遺傳多樣性,對種質資源的分類、親本選配、后代遺傳變異程度及雜種優(yōu)勢水平的預測提供預見性的指導，這是關系到育種目標能否成功實現的關鍵[4]。以往對核桃種質資源的研究多依靠形態(tài)學[5]、細胞學[6]、酶學[7]等手段。近年來，DNA 分子標記由于具有多態(tài)性高、不受組織類別、發(fā)育時期和環(huán)境條件影響的優(yōu)點，越來越多地應用于核桃種質資源的研究[8]。分子標記技術具有快速、方便、直觀、成本低等特點，已經越來越普遍地應用于植物種質資源的系統(tǒng)演化、遺傳多樣性、分子輔助育種等方面的研究，成為植物種質資源遺傳基礎研究的重要技術[9-10]，在核桃種質資源研究方面的應用有不少報道[11-14]。吳燕民等[15]用RAPD標記研究了核桃屬各個種之間的親緣關系。王滑等[16]利用SSR標記揭示我國核桃和鐵核桃天然居群的遺傳多樣性及遺傳結構,為其遺傳資源的保護、可持續(xù)利用和遺傳改良提供科學依據。國外學者利用形態(tài)學、等位酶及RFLP標記對歐洲及亞洲的核桃居群作了分析比較，SSR分子標記技術是近幾年發(fā)展起來的、以PCR為基礎的DNA多態(tài)性檢測技術，具有共顯性、穩(wěn)定性好、多態(tài)性高和遺傳信息量大的特點，是較為理想的分子標記[17]。黑核桃SSR的成功提取及對核桃栽培品種的研究顯示SSR標記技術可能成為核桃屬植物多樣性研究的有效工具[18]。筆者運用SSR分子標記對西北農林科技大學資源苗圃的18份核桃材料進行遺傳多樣性和親緣關系的分析，為今后選擇親本雜交育種及種質創(chuàng)新提供理論指導。

1 材料和方法

1.1 材料的采集和處理

試驗材料包括15個核桃品種和3個實生樣品。于四月上旬，采集其新鮮嫩葉，低溫帶回實驗室，放入-80°冰箱中保存待用，所有材料均采集于西北農林科技大學核桃實驗基地。（詳見表1）

表1 供試核桃品種名稱及來源Table 1 Walnuts cultivars collected in the course of this study

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取與檢測

采用改良的CTAB法[19]提取DNA，用分光光度計和1%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA的濃度與質量（見圖1）。獲得濃度和純度符合要求的DNA，將其稀釋至100 ng·μL-1，存于-20 ℃?zhèn)溆?。DNA質量濃度（ng/μL）=A260×50×稀釋倍數

1.2.2 引物

1.2.2.1 引物的合成及來源

SSR 引物來自于黑核桃（J. nigra）和從GenBank數據庫開發(fā)的引物[20]共27對，由英濰捷基有限公司合成 。

圖1 核桃DNA提取物的電泳檢測Fig.1 Result of agarose electrophoresis of walnuts DNA

1.2.2.2 引物的篩選和退火溫度的確定

選用西洛3號、綠香和藝核1號3個品種對合成的27對引物進行擴增，篩選出擴增條帶穩(wěn)定清晰且多態(tài)性好的多條引物進行研究，并探索其退火溫度

1.2.2.3 PCR反應程序和體系的優(yōu)化

SSR反應程序采用：94 ℃變性3 min，94 ℃30 s，Tm 45 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min 延伸，最后 4 ℃保存。

由于PCR反應體系中各個因素，如Mg2+，Taq酶，dNTP，模板，和引物濃度等的大小直接影響到擴增效率，進而影響到實驗結果，因此有必要對反應體系進行優(yōu)化。體系的優(yōu)化采用采用五因素四水平L16(45)的正交實驗進行，用20 μL的反應體系，Buffer均為2 μL，不足20 μL加水補足，三次重復，各因素水平優(yōu)化結果為：Taq酶0.5 U，Mg2+4 mmol·L-1，引物 0.8 pm·L-1，模板 120 ng，dNTP0.4 mmol·L-1，10×Buffer2 μL，水 11.9 μL。

1.2.3 電泳及凝膠成像

SSR引物擴增的產物采用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，250 V欲電泳30 min后，5 μL樣與1 μL6×Loading buffer混勻后上樣，緩沖液用1×TBE，在250 V電壓下電泳3 T。電泳過后用1%的硝酸銀染色，再經過15% NaOH顯色拍照。

1.2.4 數據分析

以DM2000為標準，同一個引物擴增后，經過電泳，凝膠上同一位置上的條帶被認為屬于同一位點且具有同源性，每個條帶視為一個標記。故根據條帶的有無，記錄數據，有條帶的記錄1，無條帶的記錄0，計算多態(tài)信息含量（PIC），并經過NT-SYSpc2.1[21]軟件分析得出遺傳相似系數（GS）和樹狀圖。

式（1）中：Pi、Pj分別為群體中第i、j個等位基因頻率，k為等位基因數。

式（2）中：Ni為供試樣品i中出現的擴增片段個數，Nj為供試材料j中出現的擴增片段個數，Nij為供試材料i和j共有的擴增片段個數。用SAHN程序中的UPGMA方法進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 SSR標記結果及其引物的退火溫度，PIC值分析

篩選出來的12對引物對供試樣品進行擴增之后，把在凝膠上有同一遷移率的條帶做為一個同源位點，進行統(tǒng)計，最后從27對SSR引物中篩選出12對有穩(wěn)定擴增產物，擴增產物的片段的大小大多在100～500 bp之間。12條引物的共擴增出174條譜帶，其中多態(tài)性條帶118條，占總條帶數的67.82%。引物WGA33 擴增的條帶數最多為17條，引物ZMZ44次之為15條。引物WGA82，ZMZ31，ZMZ45 擴增的譜帶數最少，均為6條，平均每個引物擴增的條帶數為9.83條。圖1為引物ZMZ31擴增后的電泳圖譜，圖中以50 bp Ladder作為相對分子質量標準。最右側的 泳道M為來自康為世紀的50 bp Ladder 擴增的結果，其作為分子量大小的標準，中間的從左到右編號為1，2，3，……，17，18等十八個泳道依次為十八個樣品的擴增結果。

圖2 引物ZMZ31對18份供試材料的ISSR擴增電泳Fig.2 Electrophoresis pattern amplif i ed from 18 tested materials with primer ZMZ31?

對SSR的27對引物進行退火溫度的探索，運用梯度PCR進行擴增，溫度梯度設為40～56八個濃度梯度，各個引物的Tm均包含在其中。選用形態(tài)差異大的3個核桃品種西洛3號，藝核1號，綠香進行實驗，結果發(fā)現基于SSR的引物采用不同的退火溫度進行擴增后，結果表明差異不明顯，因此均采用45°進行后續(xù)試驗。引物特征見表4。

多態(tài)信息含量（polymorphism information content，PIC）是表示DNA變異程度的一個指標，反應 DNA多態(tài)高低，位點的PIC值均大于0.50,表明具有較高的多態(tài)信息量,在核桃組內遺傳分析中有廣泛的應用價值。當PIC值＞0.5 時, 標記具有高度可供信息性；0.50＞PIC＞0.25 時,標記能夠較合理的提供信息；PIC值＜0.25 時，標記可供信息性差[22]。12對引物擴增結果的PIC值，最大值為0.896 2，最小值為0.742 2，其平均值為0.815 0，其值均大于0.5，說明本研究中的12對引物擴增的位點均表現出高度多態(tài)，表明供試樣品遺傳資源非常豐富，見表2。

表2 參試8對SSR引物的特征及擴增結果Table 2 Characteristics of eight pairs of SSR primers and PCR results

2.2 遺傳相似系數分析

根據Nei等[23]的方法，18個供試樣品間的遺傳相似系數見表3，其平均遺傳相似系數為0.406 9。由表可看出，18個供試品種（優(yōu)系）中，實生類型的優(yōu)良株系間相似系數最大。實生優(yōu)系2和3的相似系數達到了1.000，實生優(yōu)系1和2，3的相似系數達到了0.888 9，0.888 9。在供試的15個優(yōu)良品種中，吐萊爾與實生優(yōu)系的相似程度最大。吐萊爾與實生優(yōu)系1，2，3的相似系數分別為0.769 2，0.805 6，0.805 6，故推斷吐萊爾與3個實生優(yōu)系親緣關系較近。品種間新疆2號和遼寧4號遺傳相似系數最大，為0.803 6，青林和西林2號之間遺傳相似系數最小，為0.159 4。綜上可知18個核桃品種豐富，可作為育種來源。

2.3 聚類分析

用軟件NSTYS-PC進行數據分析，計算出18個樣品的遺傳相似系數后，并利用不加權成對算術平均法（UPGMA）對供試材料進行聚類分析得到樹狀圖見圖2所示，NSTYS-PC數據分析顯示，樹狀圖的r值為0.833 2，在0.8和0.9之間，說明此進化樹符合較好。在遺傳相似系數閾值為0.39左右可將供試品種分成四大類：第一類1西洛3號 2.S1 3.S2 4.S3 5.清香6.西林3號 10.香玲11.吐萊爾12.溫185 13.遼寧4號 15.新疆2號；第二類7.西林2號；第三類8.維納9.契可14.藝核1號；第四類，16.青林 17.W06-1 18.綠香。

表3 供試樣品的相似系數Table 3 Similarity coefficients of tested samples

圖3 18個核桃品種的遺傳多樣性聚類?Fig.3 Dendrogram of 18 walnut varieties based on genetic similarity

3 討 論

簡單重復序(SSR)也稱微衛(wèi)星DNA，在真核生物中，存在許多2～5 bp簡單重復序列，稱為“微衛(wèi)星DNA”其兩端的序列高度保守，可設計雙引物進行PCR擴增，揭示其多態(tài)性。 SSR長度變異極大，標記的多態(tài)性非常高，信息量也很豐富；而且一旦開發(fā)出合適的特異引物，檢測分析就變得簡單易行，因而在品種鑒定和多樣性分析中有很高的應用價值。但SSR標記兩端序列保守，所以設計的引物必須與兩端保守序列互補，這給微衛(wèi)星標記的開發(fā)和應用帶來一定的困難。因此要想開發(fā)一套某種生物的微衛(wèi)星標記，是一個過程繁瑣、工作量大、效率低、花費大的工作，從而使得SSR的應用受到一定限制。目前，核桃上SSR引物的來源有兩種，一種是已經開發(fā)得來的近緣種黑核桃的SSR引物，研究顯示黑核桃微衛(wèi)星可用于核桃屬植物進化和分類學方面的研究[24]，在本實驗中引物名稱前代號為WGA的都是來自黑核桃的引物；一種是利用生物信息學方法對NCBI網上公開的5 213條胡桃ESTs序列進行EST-SSR特征分析，利用利用Primer3.0軟件對篩選出的EST序列設計引物[25]。

傳統(tǒng)分類是以主要形態(tài)特征為依據，采用分子標記技術鑒定植物品種具有快速、準確的特點，具有廣泛的應用價值，但對植物品種的分類常常與傳統(tǒng)的分類方法不一致。作為傳統(tǒng)分類的補充，SSR 標記可減少由形態(tài)描述和環(huán)境條件產生的誤差，從分子水平鑒定個體和群體間的差異，分子標記方法是通過多個不同引物給出覆蓋整個基因組的多態(tài)性信息，由于目前常用的分子標記方法如RAPD、ISSR、SSR等，標記的數量有限，不能構建飽和的SSR指紋圖譜，不能標記所有的功能基因，因此兩種分類系統(tǒng)在某些情況下不可能完全吻合。本試驗中西洛3號晚實品種與早實品種香玲、吐萊爾等早實品種列為一類，這與王紅霞等[26]在種群聚類中，把早實與晚實品種聚在一起，說明通過聚類分析難以將早實核桃和晚實核桃截然分開相一致。龐曉明等[27]對枳屬種質的 AFLP分子標記分析也得出相似的結論，羅正榮等[28]對日本甜柿、中國原產澀柿和甜柿的 RAPD 分子標記結果的聚類分析中，澀柿和甜柿同樣未被區(qū)分開。

基于分子標記的遺傳分析（親緣關系分析）為核桃育種提供參考根據雜交理論，雜交親本的親緣關系越遠，獲得雜種優(yōu)勢的可能性越大，但是遺傳距離越遠雜交成功率就越低。對這些豐富的核桃種質資源進行系統(tǒng)的評價、研究，選擇親本進行雜交育種及種質創(chuàng)新時利用分子標記輔助是當前新品種培育的一個發(fā)展方向。

[1] 郗榮庭,張毅萍.中國果樹志·核桃卷[M].北京：中國林業(yè)出版社,1996.

[2] 高煥章,張 義,李秋杰,等.世界核桃產銷概況與湖北名優(yōu)產品開發(fā)對策[J].湖北農學院學報,2000,20(2):141-143.

[3] 郗榮庭, 張毅萍.中國核桃.北京:中國林業(yè)出版社,1992.

[4] 高 翔,龐紅喜,裴阿衛(wèi).分子標記技術在植物遺傳多樣性研究中的應用[J] 河南農業(yè)大學學報,2002,36(4):356-359

[5] 奚聲珂.我國胡桃屬(Juglans L.)種質資源與核桃(Juglans regia L.)育種[J].林業(yè)科學,1987,23(3): 342-350.

[6] 穆英林,郗榮庭,呂增仁.核桃屬部分種的小孢子發(fā)生及核型研究[J].武漢植物學研究.1990,8(4):301-310.

[7] 楊自湘,奚聲珂.胡桃屬十種植物的過氧化物同工酶分析[J].植物分類學報,1989,27(1):53-57.

[8] 陳 新,張士剛,魏海蓉,等.陜西核桃實生居群遺傳多樣性ISSR 分析[J].山東農業(yè)科學,2012,44(5):1-4.

[9] 湯正輝,祝亞軍,譚曉風,等. 河南連翹種群遺傳多樣性的ISSR 分析[J]. 中南林業(yè)科技大學學報,2013,33(8):32-37.

[10] 朱炳耀,楊志敏, 莊志鴻,等. 不同區(qū)域小油桐種質差異與ISSR 分子標記研究[J]. 中南林業(yè)科技大學學報,2013,33(4):13-16.

[11] 王 滑,郝俊民,王寶慶,等.中國核桃8個天然居群遺傳多樣性分析[J].林業(yè)科學,2007,43(7):121-126.

[12] 陳少瑜,楊 恩,張 雨,等.云南核桃品種遺傳多樣性的PAPD和ISSR標記研究[J].河北林果研究,2007,22(1):56-58.

[13] DANIEL P, GAO F Y, GIOVANNAA. Inter-simple sequence repeat markers for fingerprinting and determining genetic relationships of walnut (Juglans regia) cultivars[J].Amer Soc Hort Sci, 2002,127(1):75-81.

[14] 陳少瑜,張 雨,陳 霞,等.27份核桃種質資源親緣關系的ISSR分析[J].西北林學院學報,2012,27(4):108-112

[15] 吳燕民,裴 東,奚聲珂.運用RAPD對核桃屬種間親緣關系的研究[J].園藝學報,2000,27(1):17-22.

[16] 王 滑,郝俊民,王寶慶,等.中國核桃8個天然居群遺傳多樣性分析[J].林業(yè)科學,2007,43(7):120-124.

[17] 鄒喻萍,葛 頌,王曉東.系統(tǒng)與進化植物學中的分子標記[M].北京:科學出版社,2001, 68-107.

[18] Dang G S, Woeste K,Aradhya M K, et al. Characterization of 14 microsatellite markers for genetic analysis and cultivar –Identification of walnut[J]. AMER SOC HORT SCI, 2005,130(3): 348-354.

[19] 陳 靜, 王文江.適于 AFLP 分析的核桃幼葉 DNA 提取方法.河北農業(yè)大學學報,2004, 27(6):44-47.

[20] 黃少勇,張智俊,羅淑萍,等.山核桃EST-SSR 引物的篩選及通用性分析,經濟林研究[J],2013,31(3):10-15.

[21] RohlF FJ. NTSYS-pc numerical taxonomy and multivariate analysis system[M] .version 2.1.Exeter Pub New York ,2000.

[22] 況少青,張宇舟,陳 竺.基因組掃描-遺傳病相關基因定位的有力工具[J].中華醫(yī)學遺傳雜志,1997,14(2):99-103.

[23] Nei M, LIW H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases[J]. Proc Natl A cad Sci, 1979, 76(10):5269-5273.

[24] 郝艷賓,肖永強,齊建勛,等,微衛(wèi)星DNA在核桃屬近緣種同源性分析上的應用[J],北京農學院學報,2006,21(3):1-4.

[25] 秦 玥,劉夢培,傅大立,等 華仁杏SSR 標記的篩選與評價[J].經濟林研究,2013,31(3):72-76.

[26] 王紅霞,趙書崗,高 儀,等.普通核桃遺傳多樣性的 AFLP分析[J],中國農業(yè)科學, 2011,44(7):1434-1442.

[27] 龐曉明,鄧秀新,胡春根.枳屬 36 份特異種質的 AFLP 指紋圖譜構建與分析[J].園藝學報,2003,30(4):394-398.

[28] 羅正榮,李發(fā)芳,蔡禮鴻.部分中國原產甜柿種質的分子系統(tǒng)學研究[J].園藝學報,1999, 26(5): 297-301.

Application of microsatellite DNA on analyzing genetic diversity of Juglans regia

XIAO Zhi-juan, ZHAI Mei-zhi, WANG Zhen-yuan, XU Jing, LI Li, YANG Hui
(College of Forestry, North West Agriculture and Forestry University, Yangling 712100, Shanxi, China)

In order to study genetic diversity of different walnut varieties and to provide theoretical basis for breeding new varieties and obtaining new germplasm resources, the genetic diversities of the 18 Juglans regia species (including three strong and good seedling varieties) in nursery garden of North West Agriculture and Forestry University were studied by using SSR molecular marker technology.The PCR optimum system was set up; 12 primers with good repeatability and strong polymorphism were screened out from 27 primers;174 bands were amplif i ed out totally, in which 118 were pollymorphism bands, accounting for 67.82% of the total, the averaged number of the polymorphic loci of each primer was 9.8. The similarity coeff i cient between Xinjiang 2 and Liaoning 4 was the maximum (0.803 6), that between Qinglin and Xilin 2 was minimum (0.159 4)，the averaged value of the similarity coeff i cient was 0.815 0. Polymorphic information contents (PIC) ranged from 0.742 2 to 0.896 2, and all values were greater than 0.500 0. The cluster analyses with UPGMA method show that the 27 germplasm could be divided into 4 groups. It was indicated that 15 primers sites showed a high degree of polymorphism, also showed that the genetic resources of these samples were very rich.

Juglans regia; walnuts; SSR molecular markers; system optimization; genetic diversity

S722.3

A

1673-923X(2014)02-0055-07

2013-04-26

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項（201004027）

肖志娟（1987-），女，河南澠池人，碩士研究生，主要從事林木遺傳改良方面的研究；E-mail：xzj525@126.com

翟梅枝（1963-），女，河南西平人，教授， 碩士生導師，主要從事經濟林及資源利用的教學和科研工作；

E-mail：plum-zhai@163.com

[本文編校：文鳳鳴]