膜莢黃芪異黃酮3′-羥化酶基因的克隆及表達(dá)分析

于 洋，哈 洋，趙 洋，洪 國(guó)，吳松權(quán)，全雪麗

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000)

黃芪(Astragalusmembranaceus)是常用的滋補(bǔ)型中藥材之一，屬于多年生藥用草本植物，有著“補(bǔ)氣固表圣藥”的美稱[1]，藥用歷史已經(jīng)有2 000多年，是最常用的補(bǔ)氣固表藥材之一。植物的次生代謝產(chǎn)物在植物維持生命和人類健康中都起著重要作用[2]。黃芪的主要生物活性成分是黃酮類、多糖和皂苷[3]，具有排毒利尿、補(bǔ)氣固表、養(yǎng)血健脾、利水脫腫[4]等功效，經(jīng)常被用來(lái)作為利尿劑、止汗劑、免疫增強(qiáng)劑，是癌癥治療的輔助藥品。隨著黃酮類化合物研究的不斷深入，到目前為止，學(xué)者已經(jīng)從黃芪植物中分離出30多種黃酮類化合物[5]，而黃芪異黃酮是最重要的活性成分，是黃芪發(fā)揮藥用價(jià)值的物質(zhì)基礎(chǔ)[6]。毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮葡萄糖苷是異黃酮主要的成分，是評(píng)價(jià)黃芪藥材品質(zhì)的標(biāo)志性化合物[7]。

異黃酮類化合物是主要分布在豆科植物中的苯丙烷類代謝物的一個(gè)子類[8]，其中，異黃酮3′-羥化酶(Isoflavone3′-hydroxylase，I3′H)對(duì)異黃酮B環(huán)3′位置的羥化作用是催化芒柄花素合成毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的關(guān)鍵步驟，在鷹嘴豆的根和葉中均檢測(cè)到I3′H的生物活性[9]，另外，在大豆中發(fā)現(xiàn)了這種酶可以催化大豆苷元的羥基化反應(yīng)生成3′，4′，7-三羥基異黃酮,但有關(guān)于膜莢黃芪AmI3′H基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)與毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮葡萄糖苷積累的研究未見報(bào)道[10]。該研究利用RACE技術(shù)克隆黃芪I3′H基因全長(zhǎng)，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并利用熒光定量PCR技術(shù)和高效液相色譜法研究在黃芪不同器官中AmI3′H表達(dá)量和毛蕊異黃酮+毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量之間的關(guān)系，為揭示黃芪異黃酮類化合物的生物合成機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

以栽培2年生膜莢黃芪為試驗(yàn)材料，取一部分新鮮的根、莖、葉，用液氮冷凍后保存于-80℃超低溫冰箱中，用于總 RNA 提取，測(cè)定AmI3′H在不同器官中表達(dá)量；另一部分樣品于50 ℃的烘干箱中烘干至恒重，用于異黃酮的提取。

1.1.2 主要儀器

高速冷凍離心機(jī)(Hitachi)；超低溫冰箱(DW-86L388A)；凝膠成像系統(tǒng)(BioDoc-It220)；美國(guó)伯樂PCR 基因擴(kuò)增儀(T100)；熒光定量PCR(Agilent Mx3000P，美國(guó)WEALTEC)；電熱恒溫干燥箱(BAO-250A)、島津高效液相色譜儀(LC-10ATVP Plus)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-2000B)；低溫冷卻循環(huán)泵(DLSB-5L)；恒溫水浴鍋(HH-WO)；超凈工作臺(tái)(YJ-VS-2)；高溫高壓滅菌鍋(MJ-78A)；植物試樣粉碎機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的測(cè)定

采用醇提法提取根、莖、葉中的毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮葡萄糖苷，并用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定其含量[11]，毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98%。

1.2.2 總RNA 提取與 cDNA 合成

采用TRIzol一步法提取總RNA(Invitrogen)，利用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)其吸光值[12]。分析其純度以及濃度，將總RNA稀釋成0.5 μg/L，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Toyobo)合成 cDNA 的第1條鏈。

1.2.3I3′H基因克隆

引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

根據(jù) GenBank中其他植物的I3′H基因序列的編碼區(qū)設(shè)計(jì)1對(duì)簡(jiǎn)并引物AmI3′H-ju1 和AmI3′H-jd1，以合成的cDNA 為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，退火溫度52 ℃。根據(jù)所測(cè)得的AmI3′H基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)5′-RACE引物AmI3′H-gsp1 和3′-RACE引物AmI3′H-gsp2，按照Clontech 公 司 RACE cDNA說(shuō)明書進(jìn)行RACE反應(yīng)，從膜莢黃芪的cDNA擴(kuò)增獲得RACE序列。根據(jù)所測(cè)得的I3′H基因CDS序列設(shè)計(jì)CDS引物AmI3′H-Cu1和AmI3′H-Cd1。針對(duì)獲得的AmI3′H序列設(shè)計(jì)了1對(duì)熒光定量PCR引物AmI3′H-qu1和AmI3′H-qd1。PCR產(chǎn)物用DNA 凝膠回收試劑盒(Omega)回收以后，克隆到pMD19-T 載體(Takara)，篩選陽(yáng)性克隆，測(cè)序由上海英俊生物有限公司完成并獲得I3′H基因序列。

1.2.4 生物信息學(xué)分析

分析基因的開放閱讀框(ORF)采用 Lasergene軟件包中的 EditSeq；預(yù)測(cè)編碼蛋白的分子量和等電點(diǎn)等理化性質(zhì)采用 Lasergene 軟件和 ExPasy 服務(wù)器(https://web.expasy.org/protparam/)；預(yù)測(cè)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域采用在線工具TMHMM-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)采用在線工具Psipred(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred)，預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位情況采用在線工具 TargetP1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) 和 WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)；預(yù)測(cè)信號(hào)肽采用在線工具 SignalP 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；檢索同源性氨基酸序列采用在線工具 BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2019 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，利用SPSS 23.0軟件進(jìn)行方差分析，多重比較采用Duncan新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 AmI3′H的cDNA克隆與編碼氨基酸序列分析

以膜莢黃芪根總RNA反轉(zhuǎn)錄的 cDNA第1條鏈為模板，用簡(jiǎn)并引物 PCR 擴(kuò)增，獲得了1條大約290 bp 的片段。根據(jù)I3′H片段設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行5′-RACE和3′-RACE擴(kuò)增，結(jié)果分別獲得了1條大約427 bp的5′端和1 568 bp的3′端的PCR產(chǎn) 物，并設(shè)計(jì)CDS引物，PCR擴(kuò)增結(jié)果獲得1 518 bp 全長(zhǎng)ORF(圖 1)，拼接獲得了長(zhǎng)度為1 804 bp的AmI3′H基因的全長(zhǎng)序列(圖2)。GenBank 登陸號(hào)為KY086290.1。

AmI3′H的cDNA 全長(zhǎng)為1 804 bp，開放閱讀框的長(zhǎng)度1 518 bp，5′非翻譯區(qū)為49 bp，3′非翻譯區(qū)為237 bp，polyA 尾為33 bp，推測(cè)編碼505個(gè)氨基酸，A+T含量為57.58%，G+C含量為42.42%。而且，AmI3′H蛋白具有P450蛋白特征的富含脯氨酸的基序(PPGPPTIP)和血紅素保守序列(FGLGRRACPG)(圖2下劃線部分)。

2.2 AmI3′H生物信息學(xué)分析

通過 ExPASy 網(wǎng)站分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，結(jié)果表明，AmI3′H的蛋白分子式為C2585H4125N705O739S18,分子量為57 481.64 Da，等電點(diǎn)8.24，不穩(wěn)定系數(shù)為42.89，AmI3′H蛋白的總平均親水性為-0.251，脂肪系數(shù)為98.85，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明，AmI3′H定位在膜上。利用 MEGA7 軟件的 NJ 法構(gòu)建I3′H的系統(tǒng)進(jìn)化樹可知(圖3)，AmI3′H與豆科植物刺毛黧豆(Mucunapruriens)親緣關(guān)系最近，同屬于細(xì)胞色素P450家族。雖然系統(tǒng)進(jìn)化樹基本按照不同物種分類，但不同物種氨基酸序列的相似性均在75%～99%，這充分反映了I3′H在豆科植物進(jìn)化上的保守性和一定的多態(tài)性。

2.3 不同部位毛蕊異黃酮+毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量與I3′H表達(dá)量差異性分析

分別測(cè)定在膜莢黃芪的根、莖、葉中的AmI3′H基因表達(dá)量與毛蕊異黃酮+毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量(圖4)，結(jié)果表明，在膜莢黃芪的根、莖、葉中毛蕊異黃酮+毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量存在顯著性差異，其中，葉部高于莖部，根部含量最少，即根<莖<葉。AmI3′H基因在膜莢黃芪的根、莖、葉中均有表達(dá)，表達(dá)量具有顯著性差異。其中，根部表達(dá)量最低，莖部的表達(dá)量是根部的4.25倍，而葉部表達(dá)量是根部的7.65倍，即根<莖<葉。

3 討論與結(jié)論

在黃芪的各個(gè)生長(zhǎng)階段，異黃酮類化合物在植物體內(nèi)不斷合成、消耗、降解，異黃酮類化合物的積累在植物不同器官中具有差異性[13]。而黃芪中異黃酮類化合物含量對(duì)品質(zhì)起著至關(guān)重要的作用，如何調(diào)控黃芪異黃酮類化合物含量正成為研究熱點(diǎn)。前人研究中發(fā)現(xiàn)，在大豆和鷹嘴豆中存在異黃酮3′-羥化酶促進(jìn)異黃酮類化合物的合成[14]。但關(guān)于膜莢黃芪AmI3′H基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)與毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮葡萄糖苷積累的研究未見報(bào)道。

該研究完成了對(duì)膜莢黃芪異黃酮3′-羥化酶基因的克隆，并對(duì)其進(jìn)行了生物學(xué)信息分析。AmI3′H的cDNA 全長(zhǎng)1 804 bp，開放閱讀框的長(zhǎng)度1 518 bp，推測(cè)編碼505個(gè)氨基酸，通過分析發(fā)現(xiàn)，AmI3′H蛋白具有富含脯氨酸的基序(PPGPPTIP，位于33～40位置)和血紅素保守序列(FGLGRRACPG，位于436～445位置)，與Liu等在苜蓿中發(fā)現(xiàn)的I3′H結(jié)構(gòu)相似[15]。此外，還發(fā)現(xiàn)AmI3′H蛋白的44～498氨基酸序列為PLN02687結(jié)構(gòu)域，這些都是P450酶一級(jí)結(jié)構(gòu)的特征功能[16]。推測(cè)AmI3′H蛋白具有P450酶相似的功能。

膜莢黃芪AmI3′H蛋白與豆科植物刺毛黧豆親緣關(guān)系最近，對(duì)其進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析確定了一個(gè)推定的信號(hào)肽(MAPLLYYSLLSLAFILTVKIILQIQ，位于1～25位置)，該信號(hào)肽在N端含有膜錨定序列(LY YSLLSLAFILTVKIILQI，位于5～24位置)，與豌豆和甘草中的細(xì)胞色素P450酶具有相似的結(jié)構(gòu)域[17-18]。Rajeev等[19]在木豆中也發(fā)現(xiàn)了類似的酶。Kirsten等[20]在研究中提出，I3′H蛋白與其它P450酶附著在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上組成一個(gè)“臨時(shí)工廠”完成苯丙烷代謝的分支途徑。

該研究中，AmI3′H的表達(dá)水平(圖5)與膜莢黃芪毛蕊異黃酮+毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量變化一致。AmI3′H在膜莢黃芪的根、莖、葉中的表達(dá)量為根<莖<葉，這與甘草中基因表達(dá)量變化一致[16]。前人研究表明，異黃酮類化合物參與植物對(duì)生物脅迫和非生物脅迫的防御機(jī)制，而I3′H基因的表達(dá)與植物的抗性脅迫相關(guān)[14]，推測(cè)AmI3′H基因的表達(dá)與毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的生物合成相關(guān)。

該研究從膜莢黃芪中克隆了AmI3′H基因，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，采用高效液相色譜法分析了毛蕊異黃酮和毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量，證明AmI3′H基因的表達(dá)與毛蕊異黃酮+毛蕊異黃酮葡萄糖苷的積累趨勢(shì)一致，從而為黃芪異黃酮類化合物生物合成機(jī)制的研究提供了基因資源。