金花葵花總黃酮提取條件優(yōu)化

周宇涵，徐小迪，石其宇，高 君，曹 麗

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

金花葵(HibiseumanihotL.)別名菜芙蓉、山榆皮，錦葵科秋葵屬一年生植物[1]。野生金花葵大多生長在深山崖隙間，主要分布于河北地區(qū)[2]，是瀕臨絕種的植物之一。金花葵中含有多種黃酮類化合物，是植物界中天然黃酮含量較高的品種，所含的黃酮類化合物主要有5種，分別是槲皮素-3-洋槐糖苷、金絲桃苷、槲皮素、槲皮素-3-葡萄糖苷、楊梅素[3]?，F(xiàn)階段，黃酮生產(chǎn)中應(yīng)用較廣的原料為大豆、銀杏，而這些植物的黃酮含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于金花葵[4]。金花葵能夠緩解疼痛、清熱解毒，具有提高免疫力、抗衰老氧化、降血壓血脂等功效；花蕾曬干后泡水飲用對(duì)血管擴(kuò)張有一定作用；幼果富含植物雄激素，在一定程度上對(duì)滋陰壯陽起作用；葉、莖、根等部位制作成面粉食用營養(yǎng)價(jià)值極高[5-8]。

黃酮類化合物在植物界中分布廣泛,主要存在于植物葉片和果實(shí)中,且分子量相對(duì)較低，大部分與糖結(jié)合成苷類以配基的形式存在,少數(shù)以游離形態(tài)存在[8]。目前，金花葵總黃酮提取工藝有4種，分別為有機(jī)回流法[9]、微波提取法、超聲波提取法以及酶解法[10]。前期有多篇文獻(xiàn)報(bào)道，花類藥材采用超聲波提取具有提取率高、環(huán)保無污染、提取效率快等優(yōu)點(diǎn)[11-14]，因此，該實(shí)驗(yàn)選擇超聲提取方法對(duì)金花葵花總黃酮進(jìn)行提取。金花葵是天然黃酮含量較高的植物品種之一，有研究對(duì)金花葵不同部位的總黃酮含量進(jìn)行考查。夏文寬[15]通過硝酸鋁顯色法測定金花葵花、根、莖、葉和籽等不同部位中總黃酮的含量得出該花中總黃酮含量最高。危晴和蘭蓉[16]利用紫外分光光度法測定籽中總黃酮含量為0.005～0.025 mg/mL，并且濃度與吸光度間線性關(guān)系良好，最終得出結(jié)論為總黃酮含量為2.08%。吳正超等[17]利用高效液相色譜法測定金花葵花朵中的黃酮物質(zhì)時(shí)，共分離出63個(gè)黃酮類物質(zhì)色譜峰，其中，金絲桃苷含量最多，高達(dá)11 320 mg/kg，總黃酮中含量占比為23.31%，已知的蘆丁、牡荊素鼠李糖苷、槲皮素均被檢測出。金花葵中黃酮含量可能因其產(chǎn)地、采摘時(shí)間、氣候等原因而存在差異。前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，采自長白山地區(qū)的金花葵黃酮組分及含量與其它地區(qū)存在差異，但對(duì)此金花葵中黃酮提取條件尚未進(jìn)行詳盡報(bào)道。因此，該研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)延邊地區(qū)金花葵花提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳提取工藝，為后續(xù)探索適合延邊地區(qū)金花葵生長的栽培方式提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、101-1A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)、高速多功能粉碎機(jī)(浙江武義海納電器有限公司)、RE 52-99 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)、7230G可見分光光度計(jì)(上海精密儀器儀表有限公司)、高效液相色譜儀購自日立高新技術(shù)公司的Primaide系統(tǒng)；色譜柱為Promosil C18(4.6 mm×250mm,5 μm)。

1.2 材料

金花葵花樣品采自吉林省安圖縣石門鎮(zhèn)金花葵栽培基地。

將新鮮的金花葵花置于干燥箱中60 ℃左右烘干24 h。將烘干后的花打碎成粉末，過篩備用。

1.3 方法

1.3.1 不同提取條件對(duì)金花葵花總黃酮含量的影響

參照梅洪睿[18]的方法并稍作修改后展開試驗(yàn)。稱取鮮花粉末1 g，在不同乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度及料液比等條件下，通過超聲法(40 kHz)進(jìn)行提取，離心后取其濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用相應(yīng)濃度的乙醇溶液定容，搖勻后備用。在提取時(shí)間為30 min，提取溫度60 ℃，料液比為1∶20 (g∶mL)的提取條件下，分別選擇50%，60%，70%，80%和90%乙醇作為試驗(yàn)條件進(jìn)行超聲提取，以總黃酮含量為指標(biāo)篩選提取溶劑的最佳濃度；根據(jù)確定的最高溶劑濃度80%，確定最佳提取時(shí)間，即在溫度為60 ℃，料液比1∶20 (g∶mL)的條件下，分別測定20，25，30，35和40 min的提取效果，篩選出最佳的提取時(shí)間；再以總黃酮得率最高的30 min作為提取時(shí)間，將溫度設(shè)定為30，40，50，60和70 ℃，在料液比為1∶20 (g∶mL)的條件下進(jìn)行提取，進(jìn)行提取溫度優(yōu)化試驗(yàn)；基于前面篩選確定的總黃酮含量處于最高狀態(tài)時(shí)的乙醇濃度為80%、提取時(shí)間30 min及提取溫度60 ℃為試驗(yàn)條件，分別在料液比1∶15，1∶20，1∶25，1∶30和1∶35 (g∶mL)的條件下進(jìn)行料液比篩選試驗(yàn)。

1.3.2 提取工藝優(yōu)化研究

在以上單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度及料液比，設(shè)定4因素3水平L9(34)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)(正交試驗(yàn)因素水平見表1)后，嘗試對(duì)提取條件進(jìn)行多樣化的組合(正交表頭設(shè)計(jì)見表2)，并測定各種組合條件下的黃酮提取總量，以此為依據(jù)確定提取的最佳工藝條件。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of L9 (34)

表2 L9(34)正交表頭設(shè)計(jì)Table 2 Factors and levels of L9 (34)

1.4 總黃酮提取率的測定

參照王璐姍等[19]采用分光光度計(jì)法并稍作修改后測定總黃酮含量。取3支比色管分別作為空白、樣品和樣品校正。依次精確吸取0、2.0、2.0 mL樣液于3支比色管中，再依次加入60%乙醇溶液至5.0 mL，樣品校正管中再加入5.0 mL 60%乙醇溶液定容至10 mL，然后空白及樣液依次加入5%Na2NO2溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min；加10% Al(NO3)3溶液 0.3 mL，搖勻，靜置6 min；加入1 mol/L NaOH 溶液 4.0 mL，去離子水0.4 mL，搖勻，靜置15 min，用分光光度計(jì)于510 nm波長下測定其吸光度(OD)。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出總黃酮的含量。

提取率/%=提取液中黃酮含量/所用金花葵花重量×100%

1.5 黃酮單體物質(zhì)的測定

色譜條件：流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸水溶液(50∶50)，流速1.0 mL/min，波長360 nm，柱溫35 ℃。配制濃度為1.0 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液及0.5 mg/mL的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用。再根據(jù)優(yōu)化后的提取條件，即乙醇濃度80%，提取時(shí)間30 min，提取溫度60 ℃，料液比1∶25 (g∶mL)條件下提取黃酮類化合物粗提液，4 000 r/min離心6 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，用于HPLC分析。

通過蘆丁和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黃酮單體含量。

黃酮單體含量/μg·mL-1= 線性回歸方程計(jì)算出的樣品中總黃酮含量/(進(jìn)樣體積×1/樣液稀釋后體積)

1.6 數(shù)據(jù)分析

該試驗(yàn)中利用 SPSS 22.0分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，顯著水平為0.05時(shí)，各項(xiàng)處理分別做3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取條件對(duì)總黃酮含量的影響

2.1.1 乙醇濃度

在料液比1∶20 g/mL，不同乙醇濃度(50%，60%，70%，80%和90%)，提取時(shí)間30 min的條件下，提取溫度設(shè)定為60 ℃時(shí)，研究不同乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響。乙醇濃度為50%～80%時(shí)，總黃酮含量表現(xiàn)出遞增的現(xiàn)象，當(dāng)濃度處于80%時(shí)，升至最高水平，之后開始回落，隨著乙醇濃度的提高呈遞減現(xiàn)象。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是由于溶質(zhì)達(dá)到一定比例時(shí)，總黃酮在乙醇中的溶解達(dá)到平衡狀態(tài)，繼續(xù)增加溶質(zhì)的量，反而會(huì)增加雜質(zhì)的溶出，使金花葵花提取物中總黃酮的含量下降(圖1)。

2.1.2 提取時(shí)間

在乙醇濃度為80%，料液比1∶20 (g∶mL)，不同提取時(shí)間(20,25,30,35,40 min)，提取溫度為60 ℃的條件下，研究不同提取時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響?？傸S酮提取率在20～30 min這一時(shí)間段呈上升趨勢，當(dāng)提取時(shí)間為30 min時(shí)，總黃酮提取率最高(7.81%)(圖2)。隨著提取時(shí)間的延長，提取率逐漸下降。產(chǎn)物的浸出程度與提取時(shí)間聯(lián)系緊密，若時(shí)間過短產(chǎn)物則會(huì)溶解不充分，但時(shí)間過長又會(huì)造成產(chǎn)物結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使樣品中總黃酮含量降低。綜合考慮，確定30 min為提取的最佳時(shí)間。

2.1.3 提取溫度

在乙醇濃度為80%，料液比1∶20 (g∶mL)，提取時(shí)間30 min時(shí)，選擇不同提取溫度(30，40，50，60，70 ℃)來研究總黃酮含量與提取溫度的關(guān)系(圖3)。

由圖3可知，總黃酮含量會(huì)因?yàn)樘崛囟鹊纳仙岣?，?0 ℃時(shí)達(dá)到最大提取率，隨著溫度的持續(xù)升高，總黃酮含量開始緩慢下降。其原因可能是因?yàn)檫^高的溫度在一定程度上對(duì)總黃酮的結(jié)構(gòu)造成破壞，因此，60 ℃是提取的最佳溫度點(diǎn)。

2.1.4 料液比

不同料液比對(duì)提取物中總黃酮含量的影響見圖4。

在料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30 (g∶mL)，乙醇濃度80%，提取時(shí)間30 min，提取溫度為60 ℃的條件下，研究在不同料液比條件下樣液中總黃酮提取率的變化。當(dāng)料液比為1∶10 ～1∶20 (g∶mL)時(shí)，總黃酮含量顯著提高，在料液比為1∶20 (g∶mL)時(shí)，總黃酮提取率達(dá)到最高(7.81%)。由于隨著料液比的減小，使有效成分溶出的速度加快，使總黃酮提取率增高；當(dāng)料液比在較低狀態(tài)下，有效成分無法被充分提取。綜上所述，確定最佳料液比為1∶20 (g∶mL)。

2.2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)提取條件篩選

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)方案，將乙醇濃度(A)、提取時(shí)間(B)、提取溫度(C)和料液比(D)4個(gè)因素進(jìn)行不同組合，通過研究在這些組合下對(duì)總黃酮提取率的影響。正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

由表3可知，第2組A2B2C3D1，即在乙醇濃度80%、提取時(shí)間30 min、提取溫度70 ℃、料液比1∶15 (g∶mL)這一組合中，總黃酮提取率最高(7.98%)。通過對(duì)極值R進(jìn)行比較，分析不同提取條件對(duì)總黃酮含量的影響。R值由大到小為提取溫度(C)、乙醇濃度(A)、料液比(D)、提取時(shí)間(B)，這說明對(duì)提取率影響最大的因素是提取溫度，之后依次是乙醇濃度、料液比和提取時(shí)間。計(jì)算各因素水平對(duì)總黃酮提取率的平均值K，其中，乙醇濃度(A)的K2值最大，提取時(shí)間(B)的K1值最大，提取溫度(C)及料液比(D)的K3值最大，綜上所述，最佳試驗(yàn)組合為A2B1C3D3，即當(dāng)乙醇濃度80%、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間25 min及料液比1∶25 (g∶mL)的條件下，總黃酮提取率可達(dá)到最高。

進(jìn)一步對(duì)設(shè)定的4個(gè)因素分別進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度及料液比均存在顯著的差異(表4)。因此，確定優(yōu)化后的組合為乙醇濃度80%、提取時(shí)間25 min、提取溫度70 ℃、料液比1∶25 (g∶mL)。以此組合作為試驗(yàn)條件重復(fù)3次試驗(yàn)，對(duì)總黃酮提取率進(jìn)行研究。通過表5得到，總黃酮含量在重復(fù)的3次試驗(yàn)中并未出現(xiàn)較大的差異，平均提取率為8.03%，相較于正交試驗(yàn)中第2組的提取率(A2B2C3D1，7.98%)略高一些，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的RSD(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差)是1.23%，說明該結(jié)果穩(wěn)定性較好。綜合考察得出，金花葵花中總黃酮提取的最佳提取條件為：乙醇濃度80%、提取時(shí)間25 min、提取溫度70 ℃、料液比1∶25 (g∶mL)。

表4 試驗(yàn)方差分析表Table 4 Test analysis of variance table

表5 試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證Table 5 Verification of test results

2.3 黃酮單體物質(zhì)含量

以標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖為參考，對(duì)比樣品溶液在相同色譜條件下形成的色譜圖，通過一致的保留時(shí)間能夠明確樣品內(nèi)所含的黃酮類化合物成分；將黃酮類標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入到樣品溶液中，通過峰高的變化可以進(jìn)一步明確色譜峰的歸屬。綜合上述方法對(duì)金花葵花中黃酮類化合物的組成進(jìn)行分析，圖5和圖6分別為2種黃酮標(biāo)準(zhǔn)品和金花葵花提取物在360 nm檢測條件下的液相色譜圖。從出峰時(shí)間來看，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為5.840 min，槲皮素為9.264 min。樣品提取液中峰1的出峰時(shí)間為5.998 min，與標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖中蘆丁的出峰時(shí)間相近，考慮實(shí)驗(yàn)操作、儀器等存在誤差，可認(rèn)為峰1為蘆丁；同理，可認(rèn)為出峰時(shí)間分別為9.274 min的峰2是槲皮素。對(duì)比發(fā)現(xiàn)金花葵花中含有蘆丁、槲皮素兩種黃酮類化合物。根據(jù)蘆丁及槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸方程，分別計(jì)算蘆丁及槲皮素含量，其中蘆丁含量較高，為114.59 mg/mL，槲皮素含量為14.04 mg/mL。

3 討論

研究表明，黃酮能明顯改善心肌缺血及縮小心梗范圍、降低血小板聚集程度、有效抑制凝血和血栓形成，對(duì)腦缺血有一定的保護(hù)作用[20]。金花葵花中含有多種黃酮類化合物，在200多個(gè)秋葵屬植物中，其最具食用、藥用、保健功能[21]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，延邊地區(qū)栽培的金花葵黃酮含量與華北地區(qū)相比較低，其組份及含量存在差異可能是由于不同的生態(tài)條件、地理位置以及遺傳性狀與其他多種因素共同作用的結(jié)果。因此，尋找與金花葵類黃酮合成相關(guān)的基因資源，對(duì)其進(jìn)行深入研究，探索基因表達(dá)與類黃酮物質(zhì)積累之間的關(guān)系并有效提高其黃酮含量具有深刻的意義。

同種植物的有效成分在不同提取條件下的提取效果不同，探究提取工藝的不斷優(yōu)化，可達(dá)到更大程度地獲得較高的提取率[22]。宋琳琳[23]用比色皿法測定金花葵中總黃酮含量，利用單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選最優(yōu)條件，得出在乙醇濃度為80%、料液比1∶25 (g∶mL)的條件下總黃酮提取率最高，這與該試驗(yàn)中篩選出的乙醇提取濃度以及料液比條件一致。王菲等[24]采用響應(yīng)面法對(duì)金花葵花總黃酮的溶劑提取條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果表明，在提取溫度為60 ℃時(shí)，總黃酮提取率最高，這與該試驗(yàn)中篩選的最佳提取溫度70 ℃相似。

隨著人們對(duì)金花葵的不斷研究，發(fā)現(xiàn)它的藥理功能受到越來越多人的關(guān)注，其藥用、食用價(jià)值都有著巨大的開發(fā)利用空間，對(duì)金花葵植株所含總黃酮及其化學(xué)成分的研究在國內(nèi)掀起了高潮，且研究成果能夠有效的帶動(dòng)延邊地區(qū)的發(fā)展,對(duì)金花葵未來的開發(fā)及綜合利用起到了潛移默化的作用。同時(shí)，由于試驗(yàn)條件的影響，收集的金花葵植株及其提取物可能并不完全，后續(xù)試驗(yàn)可加強(qiáng)樣品的補(bǔ)充，使數(shù)據(jù)更加全面。

4 結(jié)論

當(dāng)提取條件為乙醇濃度80%、提取時(shí)間25 min、提取溫度70 ℃、料液比為1∶25 (g∶mL)時(shí)，金花葵花中總黃酮提取率達(dá)到最高，為8.03%。金花葵花中含有蘆丁及槲皮素2種黃酮單體，含量分別為114.59和14.04 mg/mL。