食品中2，3-丁二酮形成機制和檢測方法的研究進展*

相啟森，馬云芳，董吉林，申瑞玲

(鄭州輕工業(yè)學院 食品與生物工程學院，河南 鄭州，450002)

2，3-丁二酮又名雙乙酰、丁二酮，是一種黃色至淺綠色且具有強烈奶油香味的重要香料。2，3-丁二酮天然存在于發(fā)酵乳制品和啤酒等發(fā)酵飲料中，1983年被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)規(guī)定為GRAS級(generally recognized as safe)，廣泛用作焙烤食品、非酒精飲料、糖果、乳制品替代品、奶油等食品的風味物質(zhì)［1-4］。最近的研究表明，2，3-丁二酮具有導致閉塞性細支氣管炎、誘導氧化應激等毒性作用，食品中2，3-丁二酮的安全性問題引起了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注［5-6］。本文綜述了食品中2，3-丁二酮形成機制和檢測方法方面的研究進展。

1 食品中2，3-丁二酮形成機制

在食品加工過程中，2，3-丁二酮的形成途徑主要包括脂質(zhì)氧化、糖類分解、美拉德反應、微生物發(fā)酵和核黃素光敏氧化等。

1.1 脂質(zhì)氧化

富含脂肪酸的食品在烹調(diào)和熱加工過程中能夠產(chǎn)生2，3-丁二酮等羰基化合物，其可能反應途徑見圖1［4］。不飽和脂肪酸在超氧陰離子(O-2·)、單線態(tài)氧(1O2)、羥自由基(·OH)等活性氧作用下發(fā)生過氧化反應，形成氫過氧化物、環(huán)氧化合物等中間產(chǎn)物，中間產(chǎn)物能夠繼續(xù)反應并生成2，3-丁二酮等活性羰基化合物［3，7］。例如，生牛乳中 2，3-丁二酮含量為 5 μg/kg，依次經(jīng) 82℃ 加熱 30 min、146℃ 加熱 4 s后，2，3-丁二酮含量升高到 38 μg/kg［8］。Jiang 等的研究表明，奶油和人造黃油中2，3-丁二酮的生成量隨加熱溫度升高而顯著升高;經(jīng)100℃和200℃加熱1 h后，人造黃油中2，3-丁二酮含量分別為(264.3±38.8)ng/g 和(2 274.5 ±442.6)ng/g［9］。

圖1 脂質(zhì)氧化形成2，3-丁二酮的可能途徑Fig.1 Proposed formation pathway of 2，3-butanedione from lipids oxidation

1.2 糖類分解

糖類化合物在加工過程中的熱分解是食品中2，3-丁二酮形成的另一種重要途徑。如圖2所示，加工過程中單糖分子發(fā)生異構(gòu)化(主要存在于果糖和葡萄糖之間)，異構(gòu)化產(chǎn)物果糖通過一系列反應形成酮-烯醇式互變異構(gòu);在堿性或酸性條件下，酮-烯醇式互變異構(gòu)中C4—C5鍵發(fā)生斷裂而形成2，3-丁二酮和乙二醛［4］。加熱溫度、時間和 pH是影響2，3-丁二酮生成的主要因素。2，3-丁二酮生成量隨加熱溫度升高、加熱時間延長而升高;蔗糖加熱過程中2，3-丁二酮形成的最適 pH值范圍為6～8［10］。對于葡萄糖，其斷鍵位置可能在C2和C3之間［11］。

圖2 糖類形成2，3-丁二酮的可能途徑Fig.2 Proposed formation pathways of 2，3-butanedione from carbonydrate

除圖1和圖2所示的2，3-丁二酮形成途徑以外，脂質(zhì)和糖類通過氧化或分解產(chǎn)生的一系列低分子量羰基自由基在吸收能量后也能夠生成包括2，3-丁二酮在內(nèi)的α-二羰基化合物［4，10］。

1.3 美拉德反應(Maillard reaction)

美拉德反應是發(fā)生于氨基化合物(蛋白質(zhì)、肽、胺、氨和氨基酸等)和羰基化合物(還原糖、脂質(zhì)以及由此而來的醛、酮等)之間的一系列形成食品中香味和色素類物質(zhì)的復雜反應［12］。2，3-丁二酮是一種重要的美拉德反應產(chǎn)物，是構(gòu)成咖啡香味的主要物質(zhì)［10］。在D-葡萄糖、氨水和亞硫酸鹽組成的美拉德反應模擬體系中，2，3-丁二酮的生成量隨葡萄糖和氨水濃度的升高而升高，而美拉德反應抑制劑Na2SO3能顯著抑制2，3-丁二酮的生成［10］。

此外，國外對美拉德反應過程中2，3-丁二酮的形成機制進行了大量研究。在［13C-2］甘氨酸/葡萄糖模擬反應體系中，70%的2，3-丁二酮分子結(jié)構(gòu)中含有1個13C原子，表明氨基酸參與了美拉德模擬反應體系中丙酮醛到2，3-丁二酮的轉(zhuǎn)化［11］。在［13C-2］甘氨酸/乙二醛模擬反應體系中，2，3-丁二酮全部被13C標記;而在［13C-2］甘氨酸/丙酮醛模擬反應體系中，2，3-丁二酮全部含有1個13C原子［11］。以上結(jié)果表明，2，3-丁二酮的形成涉及氨基酸中C原子與二羰基化合物之間的反應［11］。綜上所述，美拉德反應中除糖類化合物的熱分解反應形成2，3-丁二酮以外，氨基酸與糖類化合物降解產(chǎn)物(活性醛類化合物)之間的反應也是形成2，3-丁二酮的重要途徑。

1.4 微生物發(fā)酵

在啤酒、威士忌、法國白蘭地等發(fā)酵型酒精飲料及發(fā)酵乳制品中，2，3-丁二酮主要由微生物代謝產(chǎn)生［13-14］。影響微生物合成2，3-丁二酮的因素主要包括微生物種類、發(fā)酵底物和發(fā)酵時間等。能夠代謝產(chǎn)生2，3-丁二酮的微生物主要包括乳酸菌屬［14］、芽孢桿菌屬［14-15］、腸桿菌屬［16-17］、明串珠菌［18］以及某些酵母［13，19-20］，其底物主要包括葡萄糖、檸檬酸以及牛乳等。李妍等的研究表明，2，3-丁二酮合成能力由高到低依次為瑞士乳桿菌、干酪乳桿菌和保加利亞乳桿菌［21］。同時，微生物種類也影響了2，3-丁二酮的生成動力學。大部分乳桿菌的2，3-丁二酮產(chǎn)量隨發(fā)酵時間的延長而升高，而在菌株 Lb.casei subsp.casei 154發(fā)酵姜汁過程中，2，3-丁二酮產(chǎn)量在18 h即達到最大值并隨發(fā)酵時間的延長而降低［22］。

國內(nèi)外對乳發(fā)酵過程中2，3-丁二酮的生成途徑、生成條件及代謝調(diào)控方式等進行了大量研究，發(fā)現(xiàn)乳酸菌主要通過檸檬酸途徑和葡萄糖途徑合成2，3-丁二酮［17-19］。在乳酸菌等微生物的檸檬酸代謝途徑中(圖3)，檸檬酸在檸檬酸裂解酶的作用下裂解為乙酸和草酰乙酸，草酰乙酸經(jīng)脫羧形成的丙酮酸則進一步形成乙醛-焦磷酸硫胺素(乙醛-TPP)，乙醛-TPP經(jīng)α-乙酰乳酸合成酶催化生成的α-乙酰乳酸在O2存在條件下不穩(wěn)定，經(jīng)過非酶氧化脫羧反應形成2，3-丁二酮［23-24］。在乳酸菌等微生物的檸檬酸代謝途徑中(圖3)，乳糖、半乳糖和葡萄糖等經(jīng)一系列生化反應生成丙酮酸，丙酮酸經(jīng)一系列酶促反應和非酶氧化脫羧反應形成 2，3-丁二酮［23，25］。生成的 2，3-丁二酮不穩(wěn)定，可繼續(xù)反應生成乙偶姻和2，3-丁二醇［23］。

圖3 乳酸菌中2，3-丁二酮的代謝途徑Fig.3 Pathways for 2，3-butanedione metabolism in lactic acid bacteria

1.5 核黃素光敏氧化

Jung等證實，食品中核黃素(即VB2)經(jīng)光敏氧化也能夠形成2，3-丁二酮，其可能途徑見圖4［26］。核黃素是一種水溶性維生素，廣泛存在于牛乳、雞蛋、肉類、蔬菜等食物中。游離核黃素對光很敏感，與單線態(tài)氧的反應速率為1.01×1010(M·s)-1。光照尤其是紫外線照射下，核黃素極易發(fā)生不可逆分解，造成食品中核黃素含量的快速降低［27］。核黃素(溶解于0.1 mol/L、pH 6.5的磷酸緩沖液)經(jīng)3 000 lx的強光照射3 h即可生成2，3-丁二酮，且2，3-丁二酮生成量隨光照時間延長而升高［26］。疊氮化鈉是單線態(tài)氧的淬滅劑，可有效抑制光照誘導的2，3-丁二酮生成［26］。

圖4 核黃素與單線態(tài)氧反應生成2，3-丁二酮的可能反應途徑Fig.4 Proposed mechanism for the formation of 2，3-butanedione from riboflavin and singlet oxygen

2 食品中2，3-丁二酮檢測方法

鑒于2，3-丁二酮的潛在安全性問題，食品中2，3-丁二酮檢測方法的建立是其安全性評價的基礎［28-29］。目前，食品中2，3-丁二酮的檢測方法主要包括紫外分光光度法、熒光分析法、氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、生物傳感器法、極譜法以及化學發(fā)光法等。

2.1 紫外分光光度法

由于2，3-丁二酮結(jié)構(gòu)中不含發(fā)色團，紫外分光光度法檢測時一般需先進行顯色反應，常用的顯色劑主要包括肌氨酸和鄰苯二胺。肌氨酸比色法的原理是:在β-萘酚存在的堿性條件下，2，3-丁二酮與肌氨酸的胍基基團發(fā)生反應并形成粉色產(chǎn)物，可通過顯色40 min 后測定 525 nm 吸光度進行定量分析［22，30］。采用該方法測定2，3-丁二酮時需注意排除乙偶姻干擾，這是因為在分析測定過程中乙酰乳酸能夠通過氧化脫羧反應生成2，3-丁二酮，并且2，3-丁二酮與其代謝產(chǎn)物乙偶姻在522 nm處的吸光度類似［30］。一些學者通過2，3-丁二酮與乙偶姻形成粉色產(chǎn)物的速率不同而分別于顯色1 min和60 min測定2，3-丁二酮和乙偶姻的濃度。但1 min后，乙偶姻仍能部分參與粉色產(chǎn)物的形成，導致2，3-丁二酮的測定結(jié)果偏高［23］。

《GB/T 4928-2008啤酒分析方法》采用測鄰苯二胺比色法(EBC法)測定啤酒中2，3-丁二酮含量，其原理為2，3-丁二酮等α-二羰基化合物能夠與鄰苯二胺反應生成2，3-二羥基喹喔啉等喹喔啉類衍生物，該類物質(zhì)在335 nm下有最大紫外吸收峰，可以用比色分析法進行測定(圖5)。與肌氨酸比色法類似，由于其他聯(lián)二酮化合物具有相同的反應活性且在蒸餾過程中形成新的聯(lián)二酮化合物，該方法的靈敏性較低，測定結(jié)果為樣品中總聯(lián)二酮含量［31］。

圖5 2，3-丁二酮與鄰苯二胺反應生成喹喔啉類物質(zhì)的途徑Fig.5 Formation pathwy of quinoxaline derivative from reaction between 2，3-butanedione and 2，3-phenylenediamine

2.2 熒光分光光度法

熒光比色法也常用于2，3-丁二酮的測定［32-34］?；卩彵蕉放c2，3-丁二酮形成的化合物具有熒光特性，陳淑珠等建立了測定酒類中2，3-丁二酮的熒光檢測方法，該方法的檢測范圍為5～360 μg/L，檢測限為3.2 μg/L［34］。熒光比色法靈敏度接近氣相色譜(GC)，但其檢測結(jié)果與火焰離子化檢測氣相色譜法(GC-FID)測定結(jié)果存在一定偏差［33］。

2.3 液相色譜法和氣相色譜法

高效液相色譜法(HPLC)和氣相色譜法(GC)具有高效、快速、準確性好、靈敏度高、重現(xiàn)性好、檢測限低、定量準確等特點，廣泛應用于食品中2，3-丁二酮的檢測分析。由于2，3-丁二酮分子量較小且無發(fā)色團，色譜檢測時一般需進行化學衍生。HPLC檢測2，3-丁二酮常用的衍生劑包括鄰苯二胺［35］和4-硝基鄰苯二胺［36］，一般采用紫外檢測器［35-36］、二極管陣列檢測器［37］和質(zhì)譜檢測器［38］。Li等采用 4-硝基鄰苯二胺柱前衍生和Kromasil反相C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)檢測啤酒中的2，3-丁二酮，紫外檢測波長為257 nm。該方法的檢測范圍和檢測限分別為0.005 0 ～ 10.0 mg/L 和 0.000 8 mg/L［36］。2，3-丁二酮的氣相色譜檢測方法主要包括火焰離子化檢測氣相色譜法(GC-FID)［39］、頂空氣相色譜法(HSGC)［40］和固相微萃取-氣相色譜/質(zhì)譜法(SPME-GCMS)［41］等。Chen等建立了基于 SPME-GC-MS的奶油樣品中2，3-丁二酮的檢測方法。樣品經(jīng)聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS-DVB)固相微萃取纖維頭于37℃萃取5 min后，采用SPB-1 SULFUR色譜柱(60 m ×0.25 mm I.D，3.0 μm)進行分離，電子轟擊電離源(EI)MS檢測。該方法的檢測范圍為0.024～11.2 mg/kg，檢測限為 0.007 8 mg/kg［41］。

2.4 生物傳感器法

張介馳等利用雙乙酰還原酶(diacetyl reductase，DR)和還原型輔酶I(NADH)共固定作為工作酶膜，用Fe2+/Fe和 2，3-丁二酮還原過程中產(chǎn)生的NAD+/NADH構(gòu)建2，3-丁二酮檢測生物傳感器［42］。該方法的原理為:在2，3-丁二酮被DR還原的同時，NADH被氧化成NAD+。在雙乙酰還原酶量足夠大的情況下，NAD+生成速度和生成量與底物2，3-丁二酮濃度成正比，通過電流信號而檢測2，3-丁二酮濃度。該方法可準確檢測0.1～0.5 mg/L內(nèi)的2，3-丁二酮含量［42］。

2.5 極譜法

極譜法檢測2，3-丁二酮是基于α-二羰基化合物與鄰苯二胺反應并生成的喹喔啉類化合物。喹喔啉是極譜分析中的顯色化合物，適用于極譜分析法［43-44］。Esteve等建立了 2，3-丁二酮的極譜檢測方法，該方法的線性范圍為0～960 mg/L，對果汁、奶油和酸奶樣品的檢測線為 0.2 ～0.4 μg/L［45］。該方法同時結(jié)合了鄰苯二胺衍生反應的選擇性和極譜技術(shù)的專一性，且不需要對樣品進行復雜的前處理。

2.6 化學發(fā)光法

Kele等建立了基于2種水溶性釕復合物(RuPD和RuPP)的2，3-丁二酮化學發(fā)光法檢測法。該方法的原理是2，3-丁二酮能夠與釕復合物的二胺結(jié)構(gòu)發(fā)生反應并導致幾乎沒有發(fā)光特性的釕復合物的發(fā)光強度增強31倍［46］。該方法的檢測限能夠達到微摩爾級，并可用于細胞培養(yǎng)基中2，3-丁二酮的檢測。

3 展望

除作為香味物質(zhì)廣泛應用于食品加工，2，3-丁二酮還廣泛應用于醫(yī)藥、農(nóng)藥和精細化學品合成等領域。食品中2，3-丁二酮除來自人為添加以外，在加工過程中，脂質(zhì)、糖類、維生素等食品組分能夠通過過氧化、氧化分解、美拉德反應、光敏氧化等多種途徑形成2，3-丁二酮。雖然2，3-丁二酮被美國FDA列為GRAS級，但其安全性引起了各方面的廣泛關(guān)注。目前，國內(nèi)涉及2，3-丁二酮安全性的研究報道比較少，相關(guān)研究有待加強。在今后的研究中，首先要開展不同食品中2，3-丁二酮含量數(shù)據(jù)的收集工作，同時結(jié)合我國居民各類食物消費量，對食品來源的2，3-丁二酮攝入狀況進行風險評估。其次，應進行食品中氨基酸、脂肪和糖類等成分的組成和含量影響2，3-丁二酮生成方面的相關(guān)研究，并深入揭示不同食品組分形成2，3-丁二酮的化學反應途徑。此外，還應研究不同加工方式和工藝參數(shù)條件對食品加工過程中2，3-丁二酮生成的影響，并通過改善加工工藝等方式降低2，3-丁二酮的生成，以期保護消費者健康。

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