二喹啉甲酸法(BCA)分析蛋白多肽的原理、影響因素和優(yōu)點*

韓富亮，袁春龍，郭安鵲，張予林，李運奎

(西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西楊凌，712100)

蛋白多肽的定量分析在蛋白質組學、營養(yǎng)功能、生理代謝等研究領域有非常重要的作用。用于蛋白多肽定量的方法有很多，常用的方法包括雙縮尿法、福林-酚法(Lowry)、考馬斯亮藍法(Bradford)、二喹啉甲酸(BCA)法、凱氏定氮法等［1-3］。這些方法的原理不同，所受的影響因素也各不相同。因此，不同的方法其優(yōu)點和局限性不同，在定量分析蛋白多肽時要選擇適宜的方法。

BCA法是美國的Smiths等在1985年對Lowry法的一種改良方法。BCA法具有結果準確、靈敏快速、經濟適用等優(yōu)點，已廣泛應用于醫(yī)學、生物學、分析化學和食品等領域［1，4-11］。例如，BCA 法受表面活性劑和有機溶劑的影響較小，可用于反膠束萃取法萃取的蛋白分析［5］。受尿素的影響較小，可用于牛乳蛋白質的定量分析［6］。

文中對BCA法的原理、測定方法、影響因素和消除方法，以及BCA法的優(yōu)點進行了系統(tǒng)的論述。

1 BCA法原理

BCA法反應原理為蛋白質將二價銅離子還原成亞銅離子，后者在堿性條件下與BCA絡合生成紫紅色絡合物(圖1)。此化合物在540～590nm內有最大吸收波長，反應物的顏色和蛋白濃度在一定范圍內具有線性關系［12］。

BCA法反應原理包括2個方面［12］:一是蛋白中的肽鍵將 Cu2+還原為 Cu+，并且在60℃，肽鍵將Cu2+還原為Cu+的作用比在室溫更大;二是蛋白中的色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、胱氨酸等還原性氨基酸將Cu2+還原為Cu+，這一反應與溫度關系不大。

2 BCA測定方法

BCA 的測定方法如下［13-14］:

A 液:BCA-Na21 g、Na2CO3·H2O 2 g、酒石酸鈉0.16 g、NaOH 0.4 g、NaHCO30.95 g溶于80 mL水中，用1 mol/L NaOH調pH值至11.25，定容至100 mL。

B液:CuSO4·5H2O 4 g，加水定容至100mL。

測定時取A液100體積與B液2倍體積混合，配制成工作液。取BSA標準品適量配制成1 mg/mL的標準蛋白溶液，配制一系列蛋白濃度梯度繪制標準曲線。取樣品溶液0.1 mL與工作液2.0 mL混合，37℃保溫30 min，于562 nm處測定吸光度A，根據(jù)標準曲線計算樣品中蛋白的濃度。

BCA鈉鹽是穩(wěn)定的水溶性化合物。正常的工作液應當是果綠色。工作液在室溫保存1周，BCA結果無顯著差異［12，15］。

3 影響因素

3.1 反應溫度和時間的影響

在室溫和37℃，隨著反應溫度的上升，吸光值升高。但在不同溫度下，BCA的標準曲線相似。因此，研究者可根據(jù)需要自由選擇反應溫度［12］。在0～60 min的反應時間內，隨著反應時間的增加，吸光值上升。在室溫和37℃，顏色吸光值隨著反應時間的延長而增加，以每分鐘0.25%的速度增加［12］。在60℃反應30 min，顯色反應的A值在60 min內無顯著變化［15］。

BCA法的最低測定值與反應溫度有關。在37℃時，一般適用于濃度較高的樣品(＞50 μg/mL)，但是色氨酸、酪氨酸和肽鍵在此溫度下得不到徹底的氧化(37℃檢測的蛋白濃度范圍為20～2 000 μg/mL);在60℃(增強法)，一般適用于濃度較低的樣品(＜50 μg/mL)，色氨酸、酪氨酸和肽鍵在此溫度下能得到充分氧化。因此，能大大提高檢測靈敏度(60℃檢測的最低蛋白質濃度可達 5 μg/mL)［16］。

3.2 反應pH的影響

當樣品和工作液以1∶20混合時，樣品中含有0.1mol/L HCl或0.1mol/L NaOH不影響B(tài)CA法測定蛋白［12］。蛋白溶液樣品的 pH 值為 4.0、6.7、8.0時對BCA測定無顯著影響［9］。隨著pH值從12降低到11，反應的顏色下降。但是，在pH 11.25，反應顏色產生的速率最快［12］。

BCA測定A液由Na2CO3和NaHCO3組成緩沖溶液，將緩沖溶液的pH從11.25降低到10.7，可以增強緩沖溶液的緩沖能力，從而增強對樣品pH值的耐受范圍。但是，反應的顏色會有一定的下降［17］。將反應體系的pH值從11.25降低到9.4，可以將反應體系中的酒石酸鈉試劑去除，從而可以簡化反應液的配制［18］。

3.3 還原劑的影響

麥芽糖、葡萄糖、a-乳糖、VC、VB1影響 BCA 的測定［4，9］。果糖、乳糖、葡萄糖、N-乙?；咸烟前?、半乳糖和甘露糖對BCA的影響順序減弱［19］。非還原性糖，蔗糖和a-甲基葡萄糖對BCA的影響較小。在750 μg/mL蛋白的濃度下，添加 0.012 5 ～0.125 mol/L非還原糖，蛋白量增加6% ～15%［20］。

多酚化合物可以將二價銅離子還原為一價銅離子，從而影響 BCA 和銅離子的反應［1，21］。因此，BCA法不能直接用于含有多酚化合物的蛋白樣品分析，例如葡萄酒。此外，與蛋白結合的糖和多酚也會影響蛋白的測定［1，22］。

3.4 蛋白增溶劑的影響

尿素影響Lowry法、BCA法和考馬斯亮藍法定量分析蛋白，并且具有濃度效應。在空白對照中，尿素并沒有背景讀數(shù)。因此，尿素對蛋白測定的影響是造成蛋白的伸展，肽鍵或者氨基酸殘基暴露，從而使背景讀數(shù)增加，影響蛋白定量［23］。但是尿素在0.5～6 mol/L內，對BCA測定蛋白量的影響在±5%以內。蛋白濃度在0～2 000 μg/mL內，具有良好的線性關系;分別加入 100 μg/mL 和 1 000 μg/mL 蛋白，其加標回收率在98% ～103%和99.9% ～100.2%［6］。

細胞裂解液(尿素、硫脲、Chaps、DTT、EDTA、pH)影響B(tài)CA法定量蛋白［24］。BCA法測定允許的最高濃度是:尿素 3 mol/L，Tris 250 mmol/L，Chaps 5%，吐溫20 5%，Triton X100和DTT 1 mmol/L。1%Chaps影響Lowry法，但是2%的Chaps幾乎不影響B(tài)CA和考馬斯亮藍法［23］。0.125% ～0.5%的 DTT影響Lowry法和BCA法，而在此范圍內，不影響考馬斯亮藍法［23］。2種或3種凝膠電泳成分組合后，對BCA法蛋白測定具有協(xié)同或拮抗效應，而不是單純的增加效應［23］。尿素和Tris對BCA法的影響具有協(xié)同效應［25］。因此，BCA法能夠耐受的組合濃度需要實驗后確定。

兩性電解質(ampholytes，IPG)影響 Lowry法、BCA法和考馬斯亮藍法的測定。IPG嚴重影響Lowry法測定，并具有劑量效應。在兩性電解質中，三肽結構或三肽類似結構催化雙縮脲反應中的銅離子還原［23，26］。

BCA法對增溶蛋白的去污劑耐受力強，4 mol/L的鹽酸胍和3 mol/L的脲對其無影響［15］。SDS顯著影響考馬斯亮藍法的測定［23］，而BCA法對SDS具有一定的耐受性。

此外，銅離子螯合劑-EDTA顯著影響B(tài)CA法測定。因為EDTA螯合銅離子，阻止了蛋白和銅離子的反應［1］。

3.5 氨基酸的影響

除了還原性氨基酸影響B(tài)CA法以外，其他一些氨基酸也影響B(tài)CA反應［27-28］。甘氨酸和賴氨酸的濃度低于125 mmol/L時，對BCA法定量蛋白無顯著影響，測定回收率在 91% ～106%。當高于 125 mmol/L后，則影響B(tài)CA法定量蛋白［10］。

3.6 脂類物質對BCA的影響

脂類物質影響B(tài)CA法的測定，造成結果偏高。測定含有脂類的蛋白樣品時，需要用溶解脂類的有機溶劑(例如，乙醇)沉淀蛋白，用蒸餾水或去離子水重新溶解蛋白進行測定，可避免脂類物質的影響［29］。磷脂濃度在12 mg/mL的條件下，對BCA法的測定沒有影響［30］。

3.7 其他物質的影響

鈣離子影響B(tài)CA法測定蛋白。蛋白在750 μg/mL的濃度下，添加鈣離子0.5% ～10%，蛋白含量增加8% ～13%［20］。生物胺也可以把二價銅離子還原為一價銅離子，從而影響B(tài)CA法定量分析蛋白［31］。

4 干擾因素的消除方法

食品基質成分復雜，直接用BCA法定量分析蛋白容易受到很多干擾物質的影響。例如，BCA法直接測定葡萄酒和啤酒中的蛋白含量，就容易受到其中很多還原糖和酚類等還原性物質的干擾［32-33］。因此，采用BCA法定量分析這樣的樣品，需要去除干擾物質后測定。

對于含有干擾BCA分析的樣品，可沉淀蛋白后測定，以消除干擾物的影響。采用乙醇、脫氧膽酸鹽或三氯乙酸(TCA)可有效去除干擾物質對BCA測定的影響［29，34］。

調整樣品的pH為BCA工作液的pH可以有效消除干擾物質的影響［12］。加入一定量的SDS，可以消除脂質對BCA法測定的影響［35］。碘乙酰胺(IAA)可以消除還原劑(例如DTT)的影響，但是當DTT/IAA的體積比在1∶10～1∶100內，IAA只能消除還原劑80%的影響，而20%的還原劑仍然會造成BCA顯著的背景讀數(shù)［23］。

用于蛋白沉淀的(NH4)2SO4、TCA、丙酮等試劑影響B(tài)CA法的測定，而1mol/L HCl可消除這些試劑的影響。因為蛋白沉淀聚集物中仍然含有沉淀試劑成分影響B(tài)CA的測定，特別是采用微量法測定蛋白。丙酮處理可以消除半胱氨酸對BCA法測定的影響。蛋白沉淀中含有的TCA可能在BCA反應中改變了反應的pH，因此對BCA反應有淬滅作用。1 mol/L HCl體積分數(shù)從1% ～4%，不影響 BCA的測定。3mol/L TCA的體積分數(shù)從1%～4%可導致蛋白含量下降10%～50%。HCl在沉淀蛋白過程中可以揮發(fā)，而TCA不揮發(fā)。溶液中高于5%的(NH4)2SO4影響B(tài)CA法的測定。因此，蛋白沉淀中低于5%的(NH4)2SO4可被簡單的蛋白沉淀方法所消除［36］。

5 BCA法優(yōu)點

BCA法可分為常量法和微量法2種［37-38］。常量法的反應液和樣品的總體積在1～4 mL，微量法在20 ～200 μL［37-38］。其中微量法快迅、節(jié)省試劑和藥品，特別適合于測定大量樣品。采用微量法時，對0.5 ～10 μg/mL 的蛋白質樣品可準確測定［12，15］。以不同蛋白作為標準品進行定量分析，BCA法測定值變化較小(肽鍵反應)［2，15］。

Lowry法將雙縮脲反應和福林-酚反應結合，使測定蛋白的靈敏度大大提高。但是，很多能和福林-酚試劑反應的化合物都會影響蛋白的測定。例如，多酚類化合物。與Lowry法相比，BCA法所用試劑及生成的呈色物質更加穩(wěn)定。與Lowry法和Bradford法相比，BCA法的顯著優(yōu)點是受雜質影響較?。?］。影響B(tài)CA法、Lowry法和考馬斯亮藍法的干擾物見表1和表2［12，39］。含有還原劑或銅離子螯合劑的樣品適合采用考馬斯亮藍法，而含有表面活性劑的樣品適合采用 BCA 法［3］。

表1 影響B(tài)CA和Lowry法測定的干擾物Table 1 Interfering substances of BCA and Lowry methods

續(xù)表1

表2 影響考馬斯亮藍法測定的干擾物Table 2 Interfering substances of Bradford method

BCA法的反應原理是蛋白分子中的肽鍵在堿性條件下將二價銅離子還原為一價銅離子，后者與BCA結合形成紫色絡合物。因此，BCA法可用于小分子多肽的測定。含0.1g/mL SDS的0.1 mol/L NaOH多肽溶液在95℃熱變性5 min，采用BCA法在37℃加熱30 min可快速、準確經濟地測定未知樣品的多肽含量［40］。BCA法測定多肽的加標回收率在96% ～107%［7］。

Bradford法的反應原理是蛋白質分子內帶正電荷的賴氨酸、精氨酸及組氨酸殘基與考馬斯亮藍染料分子內帶負電荷的基團結合，從而可以測定蛋白含量。考馬斯亮藍法是通用的、靈敏的、半定量的方法。蛋白標準品不同，含有的賴氨酸、精氨酸和組氨酸的比例不同，采用考馬斯亮藍法測定的蛋白含量就不相同。因此，采用考馬斯法定量蛋白需要選用適宜的蛋白標準品［27］?？捡R斯亮藍染料分子不與單體精氨酸、賴氨酸以及相對分子質量小于3 000的多肽結合。所以考馬斯亮藍法不適用于對多肽化合物的定量測定，特別是小分子的多肽化合物［27，41］。此外，黃酮類化合物和堿性緩沖液影響考馬斯亮藍法的測定［2］。

雙縮脲法的反應原理是蛋白分子中的肽鍵在堿性條件下與銅離子反應形成紫色絡合物，反應形成的顏色與蛋白的分子質量和氨基酸殘基無關。因此，雙縮脲法可用于測定蛋白和多肽，但是靈敏度低，適合測定含量較高的樣品。BCA、考馬斯亮藍法和Lowry法適合測定蛋白含量在0.02-2 mg/mL的樣品。BCA法和其他方法的靈敏度和線性范圍見表3［3］。

表3 四種蛋白測定方法的比較 mg/mLTable 3 Comparison of four protein determination methods mg/mL

6 結論

BCA法試劑配制簡單、操作方便、反應產物穩(wěn)定、檢測靈敏度高、線性范圍寬，受蛋白標準品的影響較小。BCA法對NaCl、NaOH和SDS等蛋白提取溶劑有一定的耐受性，是優(yōu)越的蛋白定量分析方法之一。但是，影響B(tài)CA方法的因素很多，采用BCA法進行蛋白定量分析需要考慮樣品中干擾物的影響，特別是含有復雜組成成分的食品基質。因此，采用BCA法定量分析蛋白應進行實驗以確定BCA法的準確性和可靠性。

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