聚丙烯膜固定化轉谷氨酰胺酶的條件優(yōu)化

錢 鐳 ， 任德財 ， 韓春然 ， 張 娜 ， 劉 穎 ， 馬永強 *

（1.黑龍江東方學院 食品與環(huán)境工程學部，黑龍江哈爾濱150086；2.哈爾濱商業(yè)大學 食品工程學院，黑龍江哈爾濱 150076）

轉谷氨酰胺酶（TGase；EC2.3.2.13；全稱為蛋白質-谷氨酰胺γ-谷氨酰胺基轉移酶）是一種能催化多肽或蛋白質的谷氨酰胺殘基的γ-羥胺基團（?；墓w）與許多伯胺化合物（酰基受體）之間的酰基轉移反應的酶[1-2]。蛋白質經(jīng)TG改性后其凝膠特性、粘性、持水性、水溶性和熱穩(wěn)定性等功能特性都會得到一定程度的改善[3-4]，另外還可保護食品中的賴氨酸免受各種加工過程的破壞。同時由于反應過程中有谷氨酸的生成，在一定程度上還可改善食品的風味。但是游離酶因穩(wěn)定性差、難以回收、易混入產(chǎn)品和不易循環(huán)利用等缺點，使其應用受到限制。通過物理或化學的方法將酶固載于載體后可以克服游離酶的弱點。固定化酶不僅保留了游離酶原有的活性及高度選擇性，而且克服了游離酶催化反應不便于連續(xù)化和自動化的缺點，因而具有更加廣闊的應用前景。

聚丙烯膜由于具有良好的物理和化學穩(wěn)定性，易于控制的微孔結構以及制備方便等特點，得到了廣泛的應用。然而，其化學惰性的表面也為酶固定化帶來了困難。通過接枝聚合，進而共價結合酶分子，是聚丙烯膜固定化酶的一種有效手段。

通過紫外光引發(fā)甲基丙烯酸甲酯的接枝聚合，在聚丙烯微孔膜表面引入反應性官能團，實現(xiàn)轉谷氨酰胺酶在化學惰性聚丙烯膜上的共價固定化，優(yōu)化了接枝反應和固定化條件，得到一種比較理想的酶晶體膜固定化方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

轉谷氨酰胺酶晶體：實驗室自制；聚丙烯微孔膜：北京升河誠信膜科技發(fā)展中心產(chǎn)品；甲基丙烯酸甲酯（化學純）：上?；瘜W試劑采購供應五聯(lián)化工廠產(chǎn)品；1，6-己二胺（化學純）：上?；瘜W試劑采購供應五聯(lián)化工廠產(chǎn)品；三羥甲基氨基甲烷（tris）：北京北實縱橫科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；還原型谷胱甘肽：sigma 公司產(chǎn)品；N-α-CBZ-Gln-Gly：sigma 公司產(chǎn) 品 ；L-Glutamic acid γ -monohydroxamic acid：sigma公司產(chǎn)品；鹽酸羥胺（分析純）：天津市光復精細化工研究所產(chǎn)品。

1.2 儀器與設備

紫外光引發(fā)裝置（500W）：實驗室自制；空氣振蕩器（HEQ-C）：哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司產(chǎn)品；真空干燥箱（ZK-82B）：上海實驗儀器總廠產(chǎn)品；紫外可見分光光度計（Spectrum722E型）：上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 甲基丙烯酸甲酯在膜表面的紫外接枝方法

1）聚丙烯微孔膜的預處理 將聚丙烯膜（孔徑10 μm）置于丙酮中浸泡24 h，于真空干燥箱中30℃干燥24 h，儲存于干燥器中備用。

2）預照射 先配制0.2 mol/L光敏劑二苯甲酮的丙酮溶液，將已稱重（W0）的處理過的膜浸入溶液中，在氮氣保護下用紫外光照射一段時間，取出膜于空氣中自然晾干，備用。

3）第二步光照 再將上述膜浸入到含有甲基丙烯酸甲酯的乙醇溶液中，在氮氣保護下用紫外光照射一段時間后，將膜取出，用大量乙醇沖洗。再將膜浸入丙酮中，于30℃水浴振蕩器中振蕩24 h，期間每4h更換一次丙酮溶劑，將膜表面殘留的單體及均聚物徹底洗脫。清洗過的膜于真空干燥箱中30℃干燥24 h，稱重（W）。甲基丙烯酸甲酯在膜表面的接枝率（GD）按下式計算：

1.3.2 紫外接枝反應條件優(yōu)化 采用預照射時間為12 min，研究照射距離、單體濃度和二次照射時間對接枝率的影響。

1）單因素試驗 第一組控制照射距離為4，6，8，10，12，16 cm 進行單因素試驗， 研究照射距離對接枝率的影響；第二組將甲基丙烯酸甲酯的質量分數(shù)分別配制成 5%，10%，15%，20%，25%，30%，研究單體質量分數(shù)對接枝率的影響；第三組設定二次照射時間為 5，10，15，20，25，30 min，研究二次照射時間對接枝率的影響。

2）響應面試驗設計 根據(jù)單因素的結果，采用響應面Box-Benhken中心組合設計，以接枝率為響應值，以照射距離（A）、單體濃度（B）、二次照射時間（C）為自變量，設計了3因素3水平的響應面分析實驗。因素水品編碼見表1。

1.3.3 轉谷氨酰胺酶的固定化方法

1）己二胺間隔臂的引入 將己二胺溶解于去離子水中配成一定濃度的溶液，甲基丙烯酸甲酯接枝膜浸入己二胺溶液中，于空氣振蕩器上在一定溫度下振蕩一定時間。取出膜，用大量去離子水沖洗以除去吸附于膜上的己二胺?？疾炝思憾窛舛?，己二胺活化溫度，己二胺活化時間對固定化酶晶體活力的影響。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in response surface design

2）戊二醛交聯(lián) 將己二胺處理過的膜浸入戊二醛水溶液中，于空氣振蕩器上在30℃下振蕩一定時間。取出膜，用大量去離子水沖洗活化后的膜即可?？疾炝宋於舛?、交聯(lián)時間對固定化酶晶體活力的影響。

3）酶的固定化 試驗所用的酶為轉谷氨酰胺酶的交聯(lián)酶晶體，酶活力為102.8 U/mg。將表面活化的平板膜剪成3 cm×3 cm的小片，取一定數(shù)量的接枝膜浸入10 mL預處理過的酶晶體溶液中，于4℃下反應若干小時。將膜取出，用大量醋酸鹽緩沖液（0.03 mol/L，pH 6.0）沖洗，以除去表面黏附的酶液。將固定化酶晶體膜浸入醋酸鹽緩沖液 （0.03 mol/L，pH 6.0）中，于4℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

在此過程中，主要考察指標：酶晶體溶液濃度分別在 5，10，15，20，25 mg/mL 時對固定化酶晶體活力的影響情況。不同的固定化酶晶體反應時間（6，12，18，24，30，36 min）時對固定化酶晶體活力的影響情況。

1.3.4 轉谷氨酰胺酶活性的測定 轉谷氨酰胺酶活性采用Folk和Cole報導的分光Hydroxamate分析法測定[8-9]。試劑A：含0.2 mol/L tris-HCl緩沖液（pH=6.0），0.1 mol羥胺，0.01 mol還原型谷胱甘肽及0.03 mol/L N-α-CBZ-Gln-Gly的混合液；試劑B：3 mol/L HCl， 三氯乙酸及質量分數(shù) 5%FeCl3·6H2O（溶解于0.1 mol/L HCl中）等體積混合。試劑A在37℃與酶液反應10 min后，添加B終止酶反應并形成紅色鐵化合物，8 000 r/min離心5 min除去沉淀，上清液于525 nm測定吸光度，用L-谷氨酸γ-單羥肟酸 （L-Glutamic acid γ-monohydroxamic acid）做標準曲線。1單位TGase酶活力單位定義為：37 ℃每分鐘催化 1 μmol N-α-CBZ-Gln-Gly生成單羥肟酸所需酶量。

2 結果與分析

2.1 紫外接枝反應條件對接枝率的影響

2.1.1 單因素試驗結果 單因素試驗結果顯示，隨著光照距離的增加，接枝率也隨之增加，當光照距離增加到10 cm時，接枝率基本上達到了最大，而繼續(xù)增加光照距離之后，接枝率有所下降，故試驗中光照距離定為10 cm。甲基丙烯酸甲酯的濃度對于膜的接枝率具有較大的影響，當甲基丙烯酸甲酯質量分數(shù)為20%時，單體接枝率最大，而隨著單體濃度的持續(xù)增加，接枝率沒有太大明顯的變化，所以，在試驗中將甲基丙烯酸甲酯質量分數(shù)定為20%。第二步接枝反應時間會明顯地影響接枝率，隨著時間的增加，單體接枝率逐漸升高，在5～15 min內，接枝率的增幅較大。直至20 min左右達到接枝率最大值。同時，光照時間不可太長，時間過長會使單體溶液烤干，不利于單體的接枝，因此，二次光照的時間選擇20 min為宜。

2.1.2 響應面實驗安排及實驗結果 響應面分析實驗設計與結果見表2。

表2 試驗設計與試驗結果Table2 Response surface design arrangement and experimental results

利用Design Expert對表2的數(shù)據(jù)進行二次多項式擬合，獲得接枝率對照射距離、單體濃度以及二次照射時間的二次回歸方程：

GD=34.50-0.030A-0.99B+0.53C-0.47AB+0.24AC-0.60BC-1.52BD-1.32A2-2.58B2-1.19C2

2.1.3 多元回歸模型分析 對擬合的二次多次多項式中3個自變量進行方差分析，結果見表3。由表3方差分析可知，模型P值（0.000 2）遠遠小于0.05，此時回歸方差模型是高度顯著的，因此這種實驗方法是可靠的。決定系數(shù)R2=0.967 0，說明回歸方程的擬合程度較好。

表3 實驗結果方差分析表Table 3 Variance analysis of fiited regression model

三因素之間的交互作用見圖1～3所示。當二次照射時間為20 min時，單體質量分數(shù)和照射距離對接枝率的影響見圖1，當單體質量分數(shù)不變時，接枝率隨著照射距離的增加而先增大后減小。當照射距離不變時，隨著甲基丙烯酸甲酯質量分數(shù)的增加，接枝率也逐漸增大，當單體質量分數(shù)達到20%時，接枝率開始下降。

當單體質量分數(shù)為20%時，照射距離和二次照射時間對接枝率的交互影響見圖2。當照射距離不變時，接枝率隨著照射時間的延長而先增加后減少，照射時間達到20 min時，接枝率為最大。當照射時間不變時，隨著照射距離的增加，接枝率也增大，當照射距離為10 cm時，接枝率開始下降。

圖1 單體質量分數(shù)和照射距離對接枝率的影響Fig.1 Effect of cross-interaction between distance of ultraviolet and consistency of methyl -methacrylate

圖2 照射距離和二次照射時間對接枝率的影響Fig.2 Effect of cross-interaction between distance of ultraviolet and time of ultraviolet

當照射距離為10 cm時，單體質量分數(shù)和二次照射時間對接枝率的交互影響見圖3。由圖3可見，當單體質量分數(shù)不變時，接枝率隨著照射時間的增加而增大，照射時間為25 min時，接枝率達到最大。當照射時間不變時，隨著單體質量分數(shù)的增加，接枝率也逐漸增大，當單體質量分數(shù)達到20%時，接枝率達到最大，隨著濃度繼續(xù)增大，接枝率逐漸下降。

2.1.4 驗證實驗 軟件提供的最佳接枝反應條件如下：照射距離為10.1 cm、單體質量分數(shù)為18.85%、二次照射時間為21.4 min。進行驗證實驗，3次實驗的平均接枝率為34.62%，這與理論預測值34.688 5比較接近，說明采用響應面優(yōu)化得到的紫外接枝反應條件參數(shù)準確可靠，按照建立的模型進行預測在實踐中是可行的。

圖3 單體質量分數(shù)和二次照射時間對接枝率的影響Fig.3 Effect of cross-interaction between consistency of methyl-methacrylate and time of ultraviolet

2.2 固定化條件對酶活性的影響

2.2.1 己二胺質量分數(shù)對固定化酶活性的影響如圖4所示，隨著己二胺質量分數(shù)的增加，酶的活性也在增加，但當己二胺的質量分數(shù)超過20%之后時，酶活性趨勢沒有了太大的變化，說明這一質量分數(shù)已足夠使胺烷基化反應進行完全。因此，己二胺質量分數(shù)一般控制在20%。

圖4 己二胺質量分數(shù)對酶活性的影響Fig.4 Effect of consistency of hexamethylendiamine on the relative activity of transglutaminase

2.2.2 胺烷基化溫度對固定化酶活性的影響 如圖5所示，隨著胺烷基化溫度的升高，酶的活性也有所增加，當溫度大于50℃時，酶活性受到了影響并有明顯的下降。因此，50℃為胺烷基化的最佳溫度。

2.2.3 胺烷基化時間對固定化酶活性的影響 如圖6所示，隨著胺烷基化反應時間的延長，酶活性在持續(xù)增加，當反應到90 min時，酶活性最高，并且隨著反應時間繼續(xù)增加，酶活性受到了影響，但下降的趨勢不明顯。因此，在試驗中，胺烷基化反應時間控制在90 min。

圖5 胺烷基化溫度對酶活性的影響Fig.5 Effect of amine alkylation temperature on the relative activity of transglutaminase

圖6 胺烷基化反應時間對酶活性的影響Fig.6 Effect of amine alkylation time on the relative activity of transglutaminase

2.2.4 戊二醛體積分數(shù)對固定化酶活性的影響選擇了體積分數(shù)1%～3%的戊二醛溶液進行研究，如圖7可知，戊二醛的體積分數(shù)對酶活力影響程度不大，而且當戊二醛的體積分數(shù)達到3%時，酶活有所減少，而當酶活在2%時，相對酶活較高，綜合各方面因素考慮，將戊二醛體積分數(shù)確定在2%。

圖7 戊二醛體積分數(shù)對酶活性的影響Fig.7 Effect of consistency of glutaraldehyde on the relative activity of transglutaminase

2.2.5 戊二醛作用時間對固定化酶活性的影響如圖8所示，戊二醛活化時間對固定化酶活性影響不大，在40 min時，酶活相對較高，而在40 min之后酶活性也受到一些影響而下降，可能是由于戊二醛與酶分子上的氨基化學鍵合后，使得酶的構象發(fā)生變化從而降低了活性[10]。故將戊二醛活化時間確定在40 min。

圖8 戊二醛作用時間對酶活性的影響Fig.8 Effect of reaction time of glutaraldehyde on the relative activity of transglutaminase

2.2.6 酶質量濃度對酶活性的影響 酶溶液濃度對酶活性的影響如圖9所示。隨著酶溶液濃度的增加，酶活力也增強，當酶溶液質量濃度為15 mg/mL時，酶活力達到最大，當酶溶液濃度繼續(xù)增加，酶活力沒有太大的變化，這說明，在15 mg/mL的酶溶液中，酶分子把戊二醛所暴露出的可偶聯(lián)的位點全部占有，使酶活性達到最大；而當酶質量濃度超過15 mg/mL的酶晶體溶液中的酶分子沒有完全占有戊二醛的偶聯(lián)位點，剩余的酶無法與戊二醛進一步結合，故酶活力沒有明顯的變化。因此，在實驗中將酶晶體溶液的質量濃度確定在15 mg/mL。

圖9 酶質量濃度對酶活性的影響Fig.9 Effect of consistency of enzyme on the relative activity of transglutaminase

2.2.7 酶固定化反應時間對酶活性的影響 由于酶晶體在4℃的低溫下保存，酶活力幾乎沒有影響，所以為防止酶晶體在固定化過程中失活，酶晶體固定化反應均在4℃的低溫下進行，因此固定化的速度較慢，需要較長時間反應。固定化時間對酶活性的影響如圖10所示，隨著反應時間的延長，聚丙烯微孔膜上固定酶晶體數(shù)量增多，酶活性變大。當固定24 h之后，反應接近完全，酶活性沒有太大的變化。因此，在試驗中酶固定化反應時間控制在24 h。

圖10 固定化時間對酶活性的影響Fig.10 Effect of immobilized time on the relative activity of transglutaminase

3 結 語

采用紫外光照射接枝的方法在聚丙烯膜表面接枝甲基丙烯酸甲酯單體，通過響應面分析得到最佳接枝條件為：照射距離為10.1 cm、單體質量分數(shù)為18.85%、二次照射時間為21.4 min。轉谷氨酰胺酶固定化的條件為：己二胺質量分數(shù)為20%，胺烷基化時間90 min，胺烷基化溫度50℃；戊二醛體積分數(shù)2%，戊二醛作用時間40 min；酶質量濃度15 mg/mL，4℃條件下固定化時間24 h，可以得到較高的酶活。

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