阿魏菇凝集素分離純化及理化性質(zhì)的研究

楊愛霞， 李應(yīng)彪， 許程劍

（石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子832000）

阿魏菇，又名阿魏側(cè)耳（Pleurotus ferulae Lenzi）阿魏蘑，屬擔(dān)子菌亞門層菌綱傘菌目側(cè)耳科側(cè)耳屬[1]，是干旱草原上具有代表性的蕈菌。原產(chǎn)于新疆草原、戈壁野生阿魏根莖上，國內(nèi)僅分布于新疆塔城、阿勒泰地區(qū)。其子實(shí)體肉質(zhì)肥厚，鮮嫩可口并且香味濃郁。而且此類菌含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)[2-3]以及凝集素等，阿魏菇還在抗腫瘤[4-5]，抗疲勞，抗誘變等免疫調(diào)節(jié)方面都有良好的開發(fā)利用前景。

凝集素是一類具有選擇性地、非共價(jià)可逆結(jié)合細(xì)胞表面糖鏈的蛋白質(zhì)或糖結(jié)合蛋白[6]。它廣泛存在于植物、動物等生物細(xì)胞膜上、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)和細(xì)胞外基質(zhì)中。其最大的特點(diǎn)在于它們能識別糖蛋白和糖脂。凝集素對糖的特異結(jié)合性決定了它在動植物體內(nèi)具有一些重要而特殊的生物學(xué)功能，利用這些功能，可以提取出大量對生物養(yǎng)殖、生物工程、疾病防治等方面展示出廣闊的應(yīng)用前景的凝集素。由此可以看出對新疆阿魏菇凝集素的提取與理化性質(zhì)研究的必要性是顯而易見的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：阿魏菇：采于新疆阿勒泰天山地帶；小鼠：石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物飼養(yǎng)中心提供。

試劑：硫酸銨（分析純）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；Tris（純度＞99.9%）；丙烯酰胺（電泳級）：北京鼎國長生生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；甲叉雙丙烯酰胺（電泳級）：北京鼎國長生生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；D-半乳糖（分析純）：上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；無水乙醇（分析純）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司產(chǎn)品；乙二胺四乙酸（分析純）：上海試劑一廠產(chǎn)品；DEAE-cellulose52（離子交換劑），瓊脂糖凝膠：北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；D36mm透析袋（XH419）：北京鼎國生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器設(shè)備

Q/TEDUC臺式高速冷凍離心機(jī)：力康發(fā)展有限公司產(chǎn)品；SH21-1恒溫磁力攪拌器：上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司產(chǎn)品；BT-200E恒流泵：上海琪特分析儀器有限公司產(chǎn)品；QT-58A智能核酸蛋白檢測儀：配有可變式恒流泵；上海琪特分析儀器有限公司產(chǎn)品；BSZ160-LCD自動部分收集器：上海琪特分析儀器有限公司產(chǎn)品；FDU-1200真空冷凍干燥機(jī)：Tokyo Rikakikai，LTD 產(chǎn)品；Ultrospec-5300紫外分光光度儀：Amersham生物科技公司產(chǎn)品。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 凝集素粗提

取適量的成熟優(yōu)質(zhì)阿魏菇，用打漿機(jī)打碎阿魏菇組織，0.02 mol/L PBS浸泡過夜；第二天對浸泡液8 000 r/min離心20 min，棄沉淀，保留上清液待用；用石油醚萃取法去除上清液中的脂肪，待石油醚揮發(fā)干凈后用體積分?jǐn)?shù)70%硫酸銨的沉淀上清液中的蛋白質(zhì)， 攪拌6～8 h，8 000 r/min離心20 min，收集沉淀?xiàng)壢ド锨逡?，將沉淀再次溶解于質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%的飽和硫酸銨，再離心收集沉淀溶解于PBS溶液中，透析除鹽36～48 h，真空冷凍干燥即得凝集素粗品。

2.2 凝集素分離純化

2.2.1 超濾 超濾[7]是一種加壓膜分離技術(shù)，即在一定的壓力下，使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過一定孔徑的特制的薄膜，使大分子溶質(zhì)不能透過，從而使大分子物質(zhì)得到了部分的純化。將凝集素粗品溶解，經(jīng)過超濾裝置截留樣液一定相對分子質(zhì)量大小，超濾6～8 h，期間補(bǔ)加蒸餾水4次，收集截留下來的樣品A備用。

2.2.2 DEAE-cellulose52層析 將樣品A裝柱于直徑為1.1 cm，柱長30 cm層析柱，填料DEAE-cellulose 52進(jìn)行分離純化，分別用濃度為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mol/L 的 NaCl溶液進(jìn)行洗脫，用自動集樣器收集洗脫液各15管，280 nm處測定紫外吸收，繪制紫外吸收曲線[8]，收集有峰值的管測定其凝血活性將其合并得到樣品B。

2.2.3 瓊脂糖凝膠層析 將Sepharose-4B與B溶液混合： 將15～20 mL B溶液與20 mL的Sepharose-4B于燒杯中混合，4℃，每隔0.5 h輕輕攪拌一次，共3 h。然后裝柱于直徑為1.1 cm，柱長30 cm層析柱。以1 mL/min的流速，用0.02 mol/L PBS洗脫雜蛋白約1 h，至基線平穩(wěn)后停止。再用0.25 mol/L D-半乳糖溶液解吸附，并控制流速為1 mL/min，收集洗脫液，至280 nm吸光度值小于0.02將樣品透析除鹽后冷凍干燥，得目的凝集素。

2.3 SDS-PAGE凝膠電泳法純度檢驗(yàn)

分離膠質(zhì)量濃度12 g/dL，濃縮膠質(zhì)量濃度5 g/dL，垂直板電泳，電壓120 V。樣品用Tris-HCl（pH 6.8）0.5 mL；SDS 0.2 g； 溴酚藍(lán) 10 mg； 甘油 1 mL；25 μL β-巰基乙醇（使用前添加）；加去離子水5 mL配制而成的緩沖液進(jìn)行處理。非變性電泳則不加SDS和β-巰基乙醇。

2.4 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的測定

精確吸取含有 20、40、60、80、100 μg 的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液0.5 mL，分別放入10 mL刻度試管中，加入5.0 mL G-250蛋白試劑，將樣品稀釋成50 μg/mL，其余操作完全相同。其操作同上。以吸光度A為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對照即可查得每毫升溶液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度[9]。

2.5 凝集素凝血活性及理化檢測

2.5.1 凝集素凝集效價(jià)的檢測 在96孔微型板上進(jìn)行，自左至右各加50 μL生理鹽水，于左側(cè)第一孔加入凝集素樣品液體，混合均勻后，吸取50 μL至第二孔，混合均勻吸取50 μL至第三孔，依次倍比稀釋，至 n 孔，吸棄 50 μL。 靜置 30～60 min，觀察結(jié)果[10]。 則蛋白液稀釋度為 1∶2；1∶4；1∶8；…1∶n。 以100%凝集（血球呈顆粒性傘狀凝結(jié)于孔底）的蛋白最大稀釋孔為該蛋白血凝效價(jià)[11]，即一個(gè)血凝單位，不凝者紅細(xì)胞沉于孔底呈點(diǎn)狀，重復(fù)4組對照試驗(yàn)。最后以對凝集素最大倍稀釋倍數(shù)（2n）來表示效價(jià)[11-12]。

2.5.2 溫度對凝血活性的影響 在V形血凝板上，均加入體積分?jǐn)?shù)1%的兔血紅細(xì)胞，于10～100℃溫度下測定凝集素的凝集效價(jià)分別靜置2 h，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果[13]。

2.5.3 pH對凝血活性的影響 采用不同pH值的緩 沖 體 系 ：pH 2，0.02 mol/L KCl-HCl；pH 3，0.02 mol/L HCl-Glv；pH 4 ～7，0.02 mol/L 檸 檬 酸 -Na2HPO4；pH 8 ～9，0.02 mol/L Tris-HCl；pH 10 ～11，0.02 mol/L NaHCO3-NaOH；pH 12～13，0.02 mol/L KCl-NaOH。測定凝集效價(jià)[14-15]。

2.5.4 陽離子對凝血活性的影響 在96孔微型板中先加入25 μL生理鹽水，然后加入樣品進(jìn)行倍比稀釋 ， 再 加入 25 μL 0.01 mol/L 的 CaCl2，CuSO4，MgCl2，ZnCl2，KCl，F(xiàn)eCl3，F(xiàn)eCl2，AlCl3溶液，4 ℃靜置2 h，再加入體積分?jǐn)?shù)1%的鼠血細(xì)胞懸液，2 h后觀察，測定凝集效價(jià)[16-17]。

2.5.5 鹽度對凝血活性的影響 在96孔微型板中先將樣品進(jìn)行倍比稀釋，再分別加入25 μL的1，10，20，30，40，50，60 g/L 濃 度的 NaCl溶液 ，2 h后加25 μL的紅細(xì)胞的懸液，振蕩混勻，4℃靜置2 h后觀察結(jié)果[16]。用25 μL生理鹽水代替鹽溶液作為空白對照。測定凝集效價(jià)。

3 結(jié) 果

3.1 凝集素粗提物離子交換層析結(jié)果

由圖1可知當(dāng)樣品通過離子交換層析時(shí)，有兩個(gè)洗脫峰，收集兩部分的洗脫液并通過凝血實(shí)驗(yàn)測得峰1凝血活性較強(qiáng)，所以主要收集峰1進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

圖1 凝集素粗提液在DEAE-52離子交換層析圖Fig.1 DEAE-cellulose chromatogram of crude extract lectin

3.2 凝集素親和層析結(jié)果圖

通過將離子交換層析后的洗脫液經(jīng)過Sepharose-4B層析在第210 min時(shí)出現(xiàn)的峰所對應(yīng)的蛋白質(zhì)具有明顯的凝血活性，收集此處溶液透析冷凍干燥得到了較純的凝集素，結(jié)果見圖2。

圖2 凝集素粗提液在Sepharose-4B親和層析圖Fig.2 Sepharose-4B affinity chromatography of lectin

3.3 凝集素電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將回收得到的凝集素樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測顯示，根據(jù)遷移率計(jì)算得相對分子質(zhì)量為17 500（圖 3），經(jīng)過 Native-PAGE 電泳檢測顯示（圖 4），凝集素的相對分子質(zhì)量也在17 500，說明阿魏菇凝集素不含有亞基結(jié)構(gòu)，且純度達(dá)到電泳純級別。

圖3 M：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品；1道：經(jīng)R-250染色的樣品Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis

圖4 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品；1.經(jīng)R-250染色的樣品Fig.4 Native-PAGE electrophoresis

3.4 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度

圖5為標(biāo)準(zhǔn)曲線，對照即可查得阿魏菇凝集素蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為為84.33 μg/mL。從蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為可以看出凝集素的成分主要是蛋白質(zhì)，含有部分糖基。

圖5 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard of Protein content

3.5 凝集素凝集效價(jià)測定及凝集效果圖

小鼠血細(xì)胞懸液在顯微鏡下的形態(tài)如圖6（a）所示，是游離的狀態(tài)；而加入凝集素樣品的血細(xì)胞懸液置于顯微鏡下觀察拍照如圖 6（b）、（c）所示，血細(xì)胞發(fā)生凝集。并且測得阿魏菇凝集素的凝集效價(jià)為28。

圖6 顯微鏡下血細(xì)胞凝集圖Fig.6 Blood cells hemagglutination of microscope

3.6 溫度對凝血活性的影響

由表1可以看出凝集素在溫度為0～40℃之間時(shí)性質(zhì)穩(wěn)定；在50～60℃之間時(shí)，凝血活性逐漸消失；在70℃以上則凝血活性全部消失。凝集素為一類特異性的糖蛋白，也具有蛋白不耐受高溫、易變性失活的特性。

表1 溫度對凝集效價(jià)的影響Table 1 Hemagglutination effect on the temperature Influence

3.7 pH值對凝血活性的影響

由表2可以看出pH條件對阿魏菇凝集素的作用較小。在pH 2～8時(shí)，凝集素凝集效價(jià)基本穩(wěn)定，凝集素活性不受影響；當(dāng)pH至9～10時(shí)，凝集效價(jià)逐漸降低，凝血活性減弱；當(dāng)pH 11以上時(shí)，凝集效價(jià)為0，凝血活性消失。說明了凝集素在酸性及中性條件下性質(zhì)穩(wěn)定，卻不耐受強(qiáng)堿。

表2 pH對凝集素凝集效價(jià)的影響Table 2 Hemagglutination effect on the pH influence

3.8 陽離子對凝血活性的影響

由表 3 可以得出 Ca2+，Mg2+，Cu2+，F(xiàn)e2+，F(xiàn)e3+，K+，Al3+等金屬離子對阿魏菇凝集素的凝集效價(jià)均有減弱的作用，而Zn2+具有增強(qiáng)凝集效果的作用，使得凝集素的效價(jià)升高至210。

表3 金屬離子對凝集素凝集效價(jià)的影響Table 3 Hemagglutination effect on the cations influence

3.9 鹽度對凝血活性的影響

由表4可知，阿魏菇凝集素的凝集效價(jià)總體變化趨勢是隨著鹽度的升高逐漸減弱，在鹽質(zhì)量濃度達(dá)到80 g/L時(shí)，凝集活性全部消失。說明凝集素活性受到鹽濃度的抑制，質(zhì)量濃度高于80 g/L以上，凝集素完全失活。其機(jī)理還有待進(jìn)一步的研究。

表4 鹽度對凝集素凝集效價(jià)的影響Table 4 Hemagglutination effect on the salinity influence

3.10 糖抑制實(shí)驗(yàn)

由表可以看出除L-阿拉伯糖、棉子糖、D-纖維二糖、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺對凝集素凝血活性無影響仍是28，而其他的糖類對凝血活性都有一定的抑制的作用，尤其是D-半乳糖抑制作用最大，由原來的28變?yōu)?2。

表5 糖對凝集素凝集活性的抑制結(jié)果Table 5 Result of inhibition on hemagglutination of lectins

4 結(jié)語

作者憑借優(yōu)越的地理位置，采集了新疆特產(chǎn)阿魏菇，并對其提取方法進(jìn)行了大量試驗(yàn)，找到了高效提取凝集素的方法。最終分離純化，得到純度較高的凝集素，通過對凝集素凝血活性的研究，了解了阿魏菇凝集素的一般理化性質(zhì)，為此類凝集素在實(shí)際應(yīng)用和免疫研究應(yīng)用奠定一定的理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1）凝集素的純化 采用超濾濃縮、離子交換層析初步分離以及瓊脂糖凝膠親和層析法純化的方高效法提取出了阿魏菇凝集素。選用的層析柱長為36 cm，直徑為1.1 cm，離子交換層析選用DEAE-cellulose52，柱材料與填料質(zhì)量比為3∶1；親和層析的填料為NaOH活化過的Sepharose-4B，柱材料與填料比為1∶1，用PBS平衡液洗脫雜蛋白至A280nm＜0.02，收集洗脫液透析跑電泳，證實(shí)無明顯的蛋白條帶；再用0.25 mol/L D-半乳糖溶液解吸附至A280nm＜0.02，流速為1mL/min，收集洗脫液透析電泳，觀察到單一的蛋白電泳條帶，證實(shí)得到純度較高的凝集素。

2）凝集素的電泳 SDS-PAGE和非變性PAGE結(jié)果均得到單一蛋白帶，相對分子質(zhì)量17 500左右，考馬斯亮藍(lán)R-250繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線測得阿魏菇凝集素蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為84.33 μg/mL。Native-PAGE是在不破壞蛋白的天然結(jié)構(gòu)和電荷的條件下，依據(jù)天然蛋白自身所帶電荷和在電場與介質(zhì)中泳動，一方面可以鑒定分離到的蛋白的純度，一方面有利于蛋白的回收利用。

3）凝集素的凝血活性 阿魏菇凝集素的最高凝集效價(jià)為28；溫度在0～40℃，凝血活性穩(wěn)定，在40℃以上，凝血活性逐漸消失，證明該凝集素不耐高溫；低pH環(huán)境下凝集素活性較為穩(wěn)定，在pH＞10以上的堿性環(huán)境下，凝血活性完全消失；陽離子中Zn2+顯著增強(qiáng)凝集素的凝血活性；D-半乳糖是它的凝血活性的抑制劑。

綜上所述利用本研究所積累的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，進(jìn)一步去篩選菌類凝集素，以找到最優(yōu)質(zhì)的凝集素，進(jìn)行大量的純化并應(yīng)用于食品領(lǐng)域。此類凝集素不僅有著高度專一的識別作用；還有著抗真菌的作用；此外還發(fā)現(xiàn)其具有酶的活性和酶抑制劑的作用。在今后的研究中可通過利用其他的菌類凝集素或其他的植物活性提取物物質(zhì)（如抗菌蛋白，肽，多糖等）做對比，從而更加全面地了解阿魏菇凝集素在生物體內(nèi)活性及其作用機(jī)理進(jìn)一步對其進(jìn)行深入研究。

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