不同形態(tài)的果糖對(duì)SD大鼠炎癥因子及內(nèi)臟組織的影響

趙艷艷， 周 星， 謝正軍*， 徐學(xué)明， 金征宇

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫 214122）

果糖攝入量與肥胖、Ⅱ型糖尿病和代謝綜合征等流行病密切相關(guān)[1]。目前，果葡糖漿和蔗糖是人類(lèi)攝入果糖的主要來(lái)源。果葡糖漿是由淀粉水解并異構(gòu)化制得的，由于其甜味獨(dú)特、成本低廉，在食品領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[2]。常用的果葡糖漿-55含55%果糖和45%葡萄糖，其與蔗糖的區(qū)別在于果糖在果葡糖漿中以游離態(tài)存在，而在蔗糖中果糖與葡萄糖以結(jié)合態(tài)存在。目前，針對(duì)游離態(tài)和結(jié)合態(tài)果糖在大鼠體內(nèi)代謝上的差異的研究較少。果葡糖漿-55和蔗糖含有果糖和葡萄糖的比例基本相同，熱量相近，且均是通過(guò)胃腸道吸收代謝，理論上來(lái)說(shuō)，這兩種物質(zhì)在代謝上并無(wú)明顯差異[3-5]。但是，近來(lái)有證據(jù)表明，蔗糖比其單體組分（葡萄糖和果糖）產(chǎn)生更高的血糖和甘油三酯[6]；與之相反，Sanchez-Lozada等專(zhuān)門(mén)研究不同形態(tài)的果糖對(duì)大鼠肝臟的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，游離態(tài)的果糖和葡萄糖能夠比蔗糖產(chǎn)生更高的血清脂質(zhì)及肝臟脂肪病變[7]。關(guān)于游離態(tài)果糖與結(jié)合態(tài)果糖在體內(nèi)代謝上是否存在差異，仍然存在很大的爭(zhēng)議。

MCP-1和TNF-α是脂肪細(xì)胞分泌的兩種炎癥因子，大量研究表明，這兩種炎癥因子與代謝綜合征的發(fā)生有著密切的聯(lián)系。TNF-α在炎性反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是引起肝損傷的NO合成的重要調(diào)節(jié)者[8]。但是，不同形態(tài)果糖代謝上的差異是否與這兩種炎癥因子有關(guān)，國(guó)內(nèi)外對(duì)其研究較少。此外，肝臟是果糖最主要的代謝場(chǎng)所，胰臟是調(diào)節(jié)血糖的主要器官，內(nèi)臟組織病變是體內(nèi)代謝紊亂最直觀的體現(xiàn)。

本研究旨在通過(guò)研究長(zhǎng)期攝入不同形態(tài)果糖的大鼠MCP-1和TNF-α以及肝臟、胰臟組織病理上的差異，為果糖形態(tài)不同所引起的代謝上的差異做出進(jìn)一步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠：體重100～120 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物合格證編號(hào)2007000539824。

1.1.2 試劑 考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量試劑盒：南京建成生物工程研究所；TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒：上海江萊生物科技有限公司；MCP-1酶聯(lián)免疫試劑盒：上海江萊生物科技有限公司；10%的福爾馬林，4%甲醛溶液。

1.1.3 器材 高速冷凍離心機(jī)：SCR 20BC；電子分析天平：AB104-N；電動(dòng)組織勻漿機(jī)：德國(guó)IKA；分光光度計(jì)：V-1800；酶標(biāo)儀：Gene 5；石蠟病理切片機(jī)：HS2205；光學(xué)顯微鏡：UB202i。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物飼喂及分組 清潔級(jí)雄性SD大鼠40只，適應(yīng)性喂養(yǎng)2 w后隨機(jī)分為5組，每組8只，分別喂食等熱量含不同種類(lèi)碳水化合物的單純?nèi)占Z，飼料配方參照文獻(xiàn)[9]。正常對(duì)照組（68%淀粉，ST組），蔗糖組（68%蔗糖，SU組），果糖葡萄糖組（34%果糖+34%葡萄糖，F(xiàn)/G組），果糖淀粉組（34%果糖+34%淀粉，F(xiàn)/ST組）以及葡萄糖淀粉組（34%葡萄糖+34%淀粉，G/ST組）。大鼠自由攝食飲水，每周稱(chēng)體質(zhì)量1次，每天稱(chēng)量采食量。

1.2.2 血清、全血及內(nèi)臟組織收集 喂養(yǎng)到第11周末，停食不停水12 h，斷尾取血，過(guò)量乙醚迷暈后，脫頸處死，解剖，心臟取血，在低溫（4℃）下3 000 r離心10 min，得血清，取肝臟、胰臟、睪周脂肪及腎周脂肪等組織，稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算肝指數(shù)及內(nèi)臟脂肪系數(shù)。肝臟（取相同部分）和胰臟用10%的福爾馬林固定，其余部分-70℃低溫凍存，待測(cè)。

肝指數(shù)=肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量；

內(nèi)臟脂肪系數(shù)=內(nèi)臟脂肪質(zhì)量/體質(zhì)量

1.2.3 血清及肝臟TNF-α、MCP-1的測(cè)定

1）血清及肝臟總蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定：血清用生理鹽水按血清∶生理鹽水=1∶49的比例稀釋待測(cè)。肝臟按質(zhì)量（g）∶體積（mL）=1∶9 的比例加入 9 倍體積的生理鹽水，冰水浴條件機(jī)械勻漿，取上清液，稀釋待測(cè)?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定總蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2）血清及肝臟TNF-α、MCP-1的測(cè)定：按照TNF-α、MCP-1 Elisa試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 肝臟和胰臟的病理變化檢查 取已固定好的肝臟和胰臟組織各一塊 （約10 mm×10 mm×2 mm），經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制成厚度為 4 μm 的切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色[10]，中性樹(shù)膠封固，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 在SPSS 16.0軟件上進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示。 組間比較采用ANOVA方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 喂養(yǎng)11 w后各組大鼠指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)正式開(kāi)始時(shí)，各組大鼠體重?zé)o差異，不同飼料喂養(yǎng)11 w后，SU組大鼠體重有高于對(duì)照ST組的趨勢(shì)，但是無(wú)顯著性差異，與對(duì)照組相比，其他各實(shí)驗(yàn)組大鼠體重差異性均不顯著，但是F/G組大鼠體重顯著低于SU組（P＜0.05）。3個(gè)含果糖的實(shí)驗(yàn)組（SU、F/G和F/ST）其內(nèi)臟脂肪系數(shù)（腎周脂肪+睪周脂肪）明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），但3個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間并無(wú)顯著性差異，此外，肝指數(shù)顯著性只體現(xiàn)在F/ST組，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠喂養(yǎng)11 w后的平均體質(zhì)量、料重比、肝指數(shù)及內(nèi)臟脂肪指數(shù)Table 1 Body weight，food（ΔBW），liver index and visceral fat coefficient after 11 weeks of specific diet （xˉ±s，n=8）

2.2 血清及肝臟MCP-1及TNF-α

血清及肝臟中炎癥因子 （MCP-1及TNF-α）的酶聯(lián)免疫法測(cè)試結(jié)果見(jiàn)圖1。與對(duì)照組相比，飼喂SU和F/ST兩種飼料的大鼠血清中的MCP-1顯著高于對(duì)照（P＜0.01），其他兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組（F/G 與 G/ST）有高于對(duì)照組的趨勢(shì)，但差異不顯著，而與SU組相比，其血清中的MCP-1顯著降低（P＜0.05）。 4個(gè)實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟中MCP-1質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于對(duì)照，但只有SU組差異顯著（P＜0.05），各實(shí)驗(yàn)組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但SU組有高于F/G組的趨勢(shì)。

各組大鼠間血清及肝臟中的TNF-α的變化趨勢(shì)與MCP-1基本一致，SU及F/ST兩組血清中的TNF-α顯著高于對(duì)照，而肝臟中的TNF-α質(zhì)量分?jǐn)?shù)只有SU組顯著升高，F(xiàn)/G、F/ST及 G/ST之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 各組大鼠血清及肝臟MCP-1和TNF-α的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.1 Serum and liver levels of MCP-1 and TNF-α in rats fed specific diet

2.3 各組大鼠肝臟、胰臟病理變化

肝臟組織HE染色切片顯示：對(duì)照組（圖2a）大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，呈多邊形、單核或雙核，基本無(wú)脂滴；含果糖實(shí)驗(yàn)組（圖2b、c、d）肝細(xì)胞脂滴數(shù)量明顯增多，部分肝細(xì)胞脂肪變性，尤其SU組（圖2b）和F/ST組（圖 2d）脂肪滴沉積明顯，大部分肝細(xì)胞已經(jīng)脂肪變性，受損；而F/G組有輕微的脂質(zhì)沉積，多數(shù)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚完整；葡萄糖組（圖2e）肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，脂滴少見(jiàn)。

圖2 各組大鼠肝臟組織病理變化（×400）Fig.2 Histologicalstructure of rat liver sections（magnification×400）

胰臟組織HE染色切片顯示：對(duì)照組（圖3a）胰島大小數(shù)量正常，大小均一，形狀規(guī)則，界限清楚；實(shí)驗(yàn)組（圖 3b、c、d、e）胰島病變不明顯，SU 組（圖3b）和F/ST（圖3d）組有輕微的胰島增生及顆粒樣變性。

圖3 各組大鼠胰臟組織病理變化（×400）Fig.3 Histological structure of rat pancreas sections（magnification×400）

3 結(jié)語(yǔ)

為了探討游離態(tài)果糖和結(jié)合態(tài)果糖在代謝上的差異，作者對(duì)比了經(jīng)過(guò)不同含糖飼料喂養(yǎng)11 w之后的大鼠血清及肝臟炎癥因子MCP-1和TNF-α以及肝臟、胰臟組織病理上的變化。研究表明，與游離態(tài)果糖（F/G）相比，結(jié)合態(tài)果糖（SU）會(huì)引起更為嚴(yán)重的代謝綜合征癥狀，具體表現(xiàn)在體重顯著增加、血清及肝臟炎癥因子濃度升高、肝臟脂質(zhì)沉積嚴(yán)重以及胰臟組織輕微病變等。此外，無(wú)游離葡萄糖（G）組F/ST比有游離G組F/G表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的炎癥因子水平及肝臟脂質(zhì)沉積，推測(cè)游離G可能對(duì)F/G的代謝起到了一定的阻礙作用。

大量研究表明，代謝綜合征（MS）患者體內(nèi)存在低度的炎癥狀態(tài)，低度的系統(tǒng)性慢性炎癥反應(yīng)可能是MS各組分之間相互聯(lián)結(jié)的樞紐[11]。本實(shí)驗(yàn)中，結(jié)合態(tài)果糖組（SU）的血清TNF-α質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于游離態(tài)果糖組（F/G）。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)均表明，TNF-α不僅是脂肪肝早期階段的媒介，更有可能導(dǎo)致更為嚴(yán)重的肝臟損傷[12-14]。有研究報(bào)道，在小兒非酒精性脂肪肝患者中，血清中的TNF-α與肝損傷指數(shù)呈顯著正相關(guān)[14]。這進(jìn)一步說(shuō)明，結(jié)合態(tài)果糖有更易產(chǎn)生代謝綜合征的趨勢(shì)和可能性，而且這種差異與TNF-α有關(guān)。此外，在本研究11 w的實(shí)驗(yàn)周期里，SU組肝臟的MCP-1及TNF-α質(zhì)量分?jǐn)?shù)有高于F/G組的趨勢(shì)，但差異并不顯著，若實(shí)驗(yàn)周期延長(zhǎng)，炎癥因子在肝臟中的表現(xiàn)可能會(huì)更加明顯。

肝臟是人體功能最活躍的合成和分解代謝器官之一，是果糖首要的代謝場(chǎng)所，若SU與HFCS代謝之間有差異，則應(yīng)該最先在肝臟中顯現(xiàn)[7]。在本研究中，含果糖組（SU、F/G及F/ST）均有不同程度的肝臟脂肪沉積，而對(duì)照組與G/ST組則沒(méi)有明顯的肝臟病變，這進(jìn)一步證實(shí)了果糖易引起代謝綜合征這一論斷。其中，與F/G組相比，SU與F/ST組肝臟脂質(zhì)沉積現(xiàn)象更為嚴(yán)重，我們推斷游離態(tài)葡萄糖（G）的出現(xiàn)可能對(duì)F/G中果糖起到了抑制作用。雖然之前有研究表明，果糖與葡萄糖代謝的通路是相互獨(dú)立的[15]，但是該研究采用的是短期靜脈注射的方法，檢測(cè)分別注射蔗糖和果糖+葡萄糖溶液的患者3 h之后的血清常規(guī)指標(biāo)，由于實(shí)驗(yàn)周期太短，所以并不排除長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)中果糖與葡萄糖有相互影響的可能。胰臟是維持血糖正常的最主要的器官，但本實(shí)驗(yàn)中并沒(méi)有明顯的胰島病變，只在SU組和F/ST組中有輕微的顆粒樣變性，究其原因可能與試驗(yàn)周期短有關(guān)，類(lèi)似的結(jié)果在文獻(xiàn)[16]也有報(bào)道。

作者經(jīng)研究認(rèn)為，高糖的飲食模式容易引起機(jī)體炎癥及內(nèi)臟組織病變，其中結(jié)合態(tài)果糖，即蔗糖的危害性大于游離態(tài)果糖（F/G），具體的炎癥通路還需要進(jìn)一步探討。同時(shí)，炎癥因子的水平可以作為預(yù)測(cè)代謝綜合征的參考指標(biāo)，并為預(yù)防糖尿病并發(fā)癥提供依據(jù)。

[1]Livesey G.Fructose ingestion：dose-dependent responses in health research[J].Journal of Nutrition，2009，139 （6）：S1246-S1252.

[2]王興安，巫冠中.果糖的代謝及其對(duì)健康的影響[J].藥學(xué)與臨床研究，2011（3）：244-246.WANG Xingan，WU Guanzhong.Fructose metabolism and its impact on health[J].Pharmaceutical and Clinical Research，2011（3）：244-246.（in Chinese）

[3]Rippe J M，Angelopoulos T J.Sucrose，high-fructose corn syrup，and fructose，their metabolism and potential health effects：what do we really know?[J].Advances in Nutrition，2013，4（27）：236-245.

[4]Akgun S，Ertel N H.The effects of sucrose，fructose，and high-fructose corn syrup meals on plasma glucose and insulin in noninsulin-dependent diabetic subjects[J].Diabetes Care，1985，8（3）：279-283.

[5]Melanson K J，Zukley L，Lowndes J，et al.Effects of high-fructose corn syrup and sucrose consumption on circulating glucose，insulin，leptin，and ghrelin and on appetite in normal-weight women[J].Nutrition，2007，23（2）：103-112.

[6]Thompson R G， Hayford J T，Hendrix J A.Triglyceride concentrations：the disaccharide effect[J].Science，1979，206（4420）：838-839.

[7]Sanchez-Lozada L G，Mu W，Roncal C，et al.Comparison of free fructose and glucose to sucrose in the ability to cause fatty liver[J].Eur J Nutr，2010，49（1）：1-9.

[8]尹學(xué)哲，許惠仙，趙文璽.草蓯蓉水萃取物對(duì)脂多糖與D-氨基半乳糖所致小鼠肝臟氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2013（5）：469-473.YIN Xuezhe，XU Huixian，ZHAO Wenxi，et al.Effect of aqueous fraction of Boschniakia rossica on hepatic oxidative stress and hepatocyte apoptosis of mice with acute liver injury induced by Lipopolysaccharide and D-galactosamine[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2013（5）：469-473.（in Chinese）

[9]Thresher J S，Podolin D A，Wei Y，et al.Comparison of the effects of sucrose and fructose on insulin action and glucose tolerance[J].Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol，2000，279（4）：R1334-1340.

[10]孫文.高果糖誘導(dǎo)大鼠肝臟脂質(zhì)沉積的機(jī)制及非諾貝特的干預(yù)作用[D].石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2011.

[11]陳啟釗.代謝綜合征患者炎癥介質(zhì)的變化[J].中華高血壓雜志，2007（8）：687-688.CHEN Qizhao.Changes of inflammatory mediators in patients with metabolic syndrome[J].Chin J Hypertension，2007（8）：687-688.（in Chinese）

[12]Crespo J，Cayon A，F(xiàn)ernandez-Gil P，et al.Gene expression of tumor necrosis factor alpha and TNF-receptors，p55 and p75，in nonalcoholic steatohepatitis patients[J].Hepatology，2001，34（6）：1158-1163.

[13]Ding W X，Yin X M.Dissection of the multiple mechanisms of TNF-alpha-induced apoptosis in liver injury[J].Journal of Cellular and Molecular Medicine，2004，8（4）：445-454.

[14]Manco M，Marcellini M，Giannone G，et al.Correlation of serum TNF-alpha levels and histologic liver injury scores in pediatric nonalcoholic fatty liver disease[J].American Journal of Clinical Pathology，2007，127（6）：954-960.

[15]Cook G C.Comparision of the absorption and metabolic products of sucrose and its monosaccharides[J].Clin Sci，1970，38：687-697.

[16]Aida Zarfeshani MSAMaHKa.Evaluating of high fructose diet to induce hyperglycemia and its inflammatory complications in rats[J].Pakistan Journal of Nutrition，2012，11（1）：991-998.