白芍總苷對腹膜纖維化大鼠HMGB-1、Smad7的影響*

張奡 湯水福 練建紅 曾科學(xué)

（1廣東省第二中醫(yī)院 廣州510095；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 廣東廣州510405；3廣東省廣州市中醫(yī)院 廣州510013）

腹膜纖維化是影響腹膜透析（peritoneal dialysis，PD）失敗的主要原因之一，如何改善腹膜纖維化是目前研究的熱點[1]。白芍總苷（the total glucosides of paeony，TGP)是白芍根中提取的一種糖苷類物質(zhì)[2]，有研究表明，白芍總苷具有抗炎及抗氧化等作用[3]。本研究通過觀察白芍總苷對大鼠腹膜纖維化模型腹膜透析液中HMGB-1、smad7的影響，來評價白芍總苷對腹膜纖維化的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物 健康SPF級雄性SD大鼠（周齡4～6周），體重180～200 g，分籠飼養(yǎng)，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供（許可證號SCXK粵2003-002）。

1.2 主要試劑與儀器藥物 白芍總苷膠囊（國藥準(zhǔn)字H20055058）、低鈣腹膜透析液（乳酸鹽-G4.25%，國 藥 準(zhǔn) 字 H44025290）、 細(xì) 菌 脂 多 糖（Lip polysaccharides，Sigma公司生產(chǎn)）、酶標(biāo)儀（Max190，美國 SPECTRA 公司）、離心機(jī)（Centrifuge5424，德國eppendorf公司）。

1.3 分組及給藥方法 選用32只大鼠隨機(jī)分為4組，每組8只，分別為：空白組、模型組、白芍總苷高劑量組、白芍總苷低劑量組?？瞻捉M每日腹腔注射生理鹽水20 mL，其他三組每日腹腔內(nèi)直接注射4.25%含糖透析液20 mL；白芍總苷高劑量、低劑量組每日腹腔內(nèi)直接注射4.25%含糖透析液20 mL的同時給予白芍總苷200 mg/（kg·d）、100 mg/（kg·d）灌胃。后三組均在第1、3、5、7天加入細(xì)菌脂多糖0.6 mg/kg（體重）腹腔注射。整個周期為30 d。

1.4 腹透液的留取及檢測 第30天將四組大鼠分別用10%水合氯醛（35 mg/kg）肌注麻醉，腹腔內(nèi)注射4.25%透析液20 mL，輕揉按摩大鼠腹部以使腹膜透析液均勻地充滿腹腔，4 h后沿腹白線剪開腹壁，用滅菌吸管吸取1 mL腹透液注入試管中進(jìn)行檢測。將腹膜透析液標(biāo)本以1 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，留取樣本。酶聯(lián)免疫分析（ELISA）檢測腹水中HMGB-1、smad7的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示，各組間差異性比較采用單因素方差分析并進(jìn)行兩兩比較（LSD法），P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 各組腹透液中HMGB-1的水平情況 ELISA結(jié)果表明：用Levene法進(jìn)行方差齊性檢驗，統(tǒng)計量為0.554，P=0.650，按α=0.05標(biāo)準(zhǔn)檢驗，可認(rèn)為各組數(shù)據(jù)方差齊。模型組、白芍總苷高濃度組、白芍總苷低濃度組腹透液中HMGB-1水平與空白組相比有所增高，白芍總苷高劑量組、白芍總苷低劑量組與模型組相比較，HMGB-1水平有所下降，但各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。因操作等原因，本項目有效標(biāo)本檢測值空白組為7個，模型組為7個，白芍總苷低劑量組為6個。見表1。

表1 各組間大鼠腹透液中HMGB-1水平比較 （±S） pg/mL

表1 各組間大鼠腹透液中HMGB-1水平比較 （±S） pg/mL

注：單因素方差分析：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＞0.05。

組別 n HMGB-1空白組模型組白芍總苷高劑量組白芍總苷低劑量組7786 7.37±1.60 8.82±1.14*7.92±1.49*#8.35±1.63*#

2.2 各組腹透液中Smad7的水平情況 ELISA結(jié)果表明：用Levene法進(jìn)行方差齊性檢驗，統(tǒng)計量為0.094，P=0.963，按α=0.05標(biāo)準(zhǔn)檢驗，可認(rèn)為各組數(shù)據(jù)方差齊。模型組與空白組比較，腹透液中Smad7的含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。白芍總苷高劑量組、白芍總苷低劑量組升高更為明顯，與空白組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組相比較，白芍總苷高劑量組、白芍總苷低劑量組腹透液中Smad7水平明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。余各組間兩兩比較，腹透液中Smad7含量無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見表2。

表2 各組間大鼠腹透液中Smad7水平比較 （±S） pg/mL

表2 各組間大鼠腹透液中Smad7水平比較 （±S） pg/mL

注：單因素方差分析：與空白組比較，*P＜0.01，#P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組別 n Smad7空白組模型組白芍總苷高劑量組白芍總苷低劑量組7786 1.66±0.37 2.28±0.46#2.82±0.52*△2.87±0.55*△

3 討論

高遷移率族蛋白-1（High mobility group protein-1，HMGB-1）是一類高度保守的蛋白質(zhì)，參與了基因調(diào)節(jié)和修復(fù)等過程[4]。作為晚期的炎癥介質(zhì)，通過糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）發(fā)揮促進(jìn)炎癥的效應(yīng)，從而在炎癥反應(yīng)性疾病的病理過程中發(fā)揮作用。HMGB-1通過磷脂酰絲氨酸結(jié)合抑制凋亡中性粒細(xì)胞的吞噬功能，參與加強(qiáng)炎癥反應(yīng)[5]。研究發(fā)現(xiàn)HMGB-1在慢性腎衰竭病變時顯著升高，有學(xué)者認(rèn)為其可能是慢性腎衰竭診斷的新指標(biāo)[6～7]。有研究提示HMGB-1作為炎癥因子也可能參與了腹膜透析相關(guān)性腹膜炎的發(fā)生[8]，但國內(nèi)外相關(guān)報道不多。HMGB-1有可能成為新的治療靶點。

TGF-β1途徑是目前公認(rèn)的腹膜纖維化發(fā)生機(jī)制之一。TGF-β1/Smads信號通路在腹膜纖維化過程中的重要作用已被多個研究所證實[9]。TGF-β1下游信號通路Smads家族中的Smad7屬抑制型Smads，它能反饋性抑制Smad通路，進(jìn)而抑制TGF-β1介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)的合成[10]從而減緩腹膜纖維化的進(jìn)程。通過上調(diào)Samd7的表達(dá)對于腹膜纖維化的防治具有潛在臨床應(yīng)用價值[9]。

白芍是我國傳統(tǒng)中藥，為毛莨科多年生草本芍藥的干燥根。白芍總苷是白芍的提取物，多用于風(fēng)濕免疫疾病方面的治療[11]。研究顯示，白芍總苷能夠抑制發(fā)生纖維化的肝組織中TGF-β1和NF-κB的表達(dá)、進(jìn)而抑制肝組織中膠原的生成以達(dá)到治療肝臟纖維化的目的[12]。芍藥苷是白芍總苷的主要的成分，占白芍總苷的90%以上，研究顯示其對LPS誘導(dǎo)的肝損傷有保護(hù)作用，可能是通過抑制晚期炎癥介質(zhì)HMGB-1的核轉(zhuǎn)位和釋放而發(fā)揮作用[13]。芍藥苷可能通過抑制HMGB-1釋放、下調(diào)細(xì)胞間黏附分子1的表達(dá)等途徑對內(nèi)皮細(xì)胞起保護(hù)作用[14]。以上結(jié)果提示白芍總苷有可能通過下調(diào)HMGB-1的表達(dá)，從而抑制炎癥相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而遏止大鼠腹膜纖維化的過程。綜合白芍總苷的上述作用，本課題提出了使用白芍總苷防治大鼠腹膜纖維化。研究發(fā)現(xiàn)，芍藥苷對LPS誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用，其途徑是通過抑制HMGB-1的釋放及細(xì)胞間黏附分子1的表達(dá)來發(fā)揮作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，各組腹透液中HMGB-1均增高，模型組最高，在灌食白芍總苷后，可一定程度下調(diào)，雖無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，但提示藥物治療可能有一定效果。考慮可能與樣本量不大及造模時間短有關(guān)，在今后的工作中將進(jìn)一步進(jìn)行研究。在灌食白芍總苷治療組中，腹透液中Smad7的含量明顯增高，說明藥物治療有效。提示白芍總苷可能通過上調(diào)Smad7水平來延緩腹膜纖維化過程，對大鼠腹膜透析模型腹膜具有一定的保護(hù)作用，其劑量與療效未發(fā)現(xiàn)正相關(guān)。

綜上，本研究表明白芍總苷對大鼠腹膜纖維化有一定的保護(hù)作用，可能通過上調(diào)Smad7水平來發(fā)揮作用，是否與HMGB-1有關(guān)還需更多的試驗證實。白芍總苷對防治腹膜纖維化有一定的治療前景。

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