生物醫(yī)用材料生物相容性評(píng)價(jià)研究進(jìn)展

袁毅君，王廷璞，陳學(xué)梅，茍黎明，姚丹

（1.天水師范學(xué)院 生物工程與技術(shù)學(xué)院，甘肅 天水 741001；2.陜西佰傲再生醫(yī)學(xué)有限公司，陜西 西安 710024）

引 言

生物醫(yī)用材料是一類具有特殊性能與特種功能的材料，用于疾病預(yù)防以及診斷、治療與康復(fù)；并可替換人體組織、器官或增進(jìn)其功能。其關(guān)鍵在于材料自身的理化性能和生物安全性、可靠性，更注重材料在體內(nèi)激活機(jī)體自我修復(fù)的能力，使受損部位結(jié)構(gòu)修復(fù)并完善功能。[1]材料與人體組織或體液接觸、相互作用時(shí)，涉及人體的反應(yīng)和人體對(duì)材料的作用，[2]生物相容性是生物醫(yī)用材料在機(jī)體內(nèi)處于動(dòng)、靜態(tài)變化過(guò)程中的反應(yīng)能力，因此必須具有良好的生物相容性、生物功能性以及良好的可加工性。生物醫(yī)用材料生物相容性評(píng)價(jià)主要有體內(nèi)組織學(xué)評(píng)價(jià)和體外細(xì)胞生物學(xué)評(píng)價(jià)兩種方法。材料直接植入動(dòng)物體內(nèi)并作用一定時(shí)間，取出觀察組織生長(zhǎng)情況即體內(nèi)組織學(xué)評(píng)價(jià)；在簡(jiǎn)化模型表面研究細(xì)胞粘附、伸展、生長(zhǎng)和生物學(xué)特性的表達(dá)為體外細(xì)胞生物學(xué)評(píng)價(jià)。[3]現(xiàn)有國(guó)內(nèi)外生物相容性的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)尚需進(jìn)一步完善，本文就生物醫(yī)用材料生物相容性評(píng)價(jià)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 生物醫(yī)用材料類型

目前生物醫(yī)用材料種類繁多，主要分為三大類：（1）天然高分子生物材料，如膠原蛋白、明膠、纖維蛋白、殼聚糖、瓊脂、糖胺多糖（如透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素等）、藻酸鹽、絲素蛋白、幾丁質(zhì)、松質(zhì)骨骨基質(zhì)、脫細(xì)胞基質(zhì)等。（2）合成高分子生物材料，如硅橡膠、聚乙烯、聚氨酯、聚丙烯酸酯聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸（PGA）等。（3）復(fù)合高分子生物材料，如明膠/硫酸軟骨素/透明質(zhì)酸鈉、聚氧化乙烯/甲殼素/殼聚糖、殼聚糖/明膠、絲素蛋白/羥基磷灰石、聚乳酸/納米羥基磷灰石/氧化石墨烯納米等復(fù)合生物材料。[4]雖然每種材料有不同的特點(diǎn)與功能，但每一類型材料具有相似點(diǎn)，見表1.[5-7]

表1 生物材醫(yī)用料類型

生物醫(yī)用材料提供組織細(xì)胞生長(zhǎng)所需的支撐介質(zhì)與環(huán)境，并協(xié)調(diào)內(nèi)環(huán)境活性因子和細(xì)胞間的相互作用，促進(jìn)細(xì)胞黏附，潛在影響細(xì)胞分化與增殖，改變細(xì)胞表面因子受體表達(dá)。所以理想的生物醫(yī)用材料應(yīng)具有：（1）優(yōu)良的生物相容性，無(wú)毒，無(wú)致畸性；（2）良好的生物可降解性和降解率：生物材料是可被吸收的，在組織形成過(guò)程中逐步分解，不影響新形成組織的結(jié)構(gòu)和功能，降解速度同步于組織再生速度；（3）材料表面活性好：促進(jìn)細(xì)胞貼附，是細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分泌基質(zhì)的理想微環(huán)境；（4）具有可塑性和一定的機(jī)械強(qiáng)度；（5）免疫原性低，不引起炎癥反應(yīng)；（6）方便加工；（7）具有可消毒性。[8-10]

2 生物醫(yī)用材料生物相容性的檢測(cè)

2.1 細(xì)胞毒性的檢測(cè)

采用體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)對(duì)生物材料和醫(yī)療器材或浸提液可濾出成分中潛在的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)是常用方法，一般以體外細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行。各種醫(yī)療器械和醫(yī)用材料臨床應(yīng)用前的必選項(xiàng)目是細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，是評(píng)價(jià)醫(yī)用材料毒性的重要指標(biāo)。[11]細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)研究周期短，已被廣泛用于生物材料生物相容性評(píng)價(jià)中，特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、敏感，節(jié)省經(jīng)費(fèi)、節(jié)約動(dòng)物。[12]

有多種方法檢測(cè)細(xì)胞毒性，GB/T16886標(biāo)準(zhǔn)分為MTT試驗(yàn)法（主要是浸提液法）、直接接觸法、分子濾過(guò)法和瓊脂覆蓋法。還有按照不同的生物學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)細(xì)胞毒性檢測(cè)進(jìn)行評(píng)價(jià)，如細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞膜效應(yīng)（LDH釋放法）、細(xì)胞代謝活性、細(xì)胞增殖率等方法。另有細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白檢測(cè)等方法評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性。不同生物材料的細(xì)胞毒性途徑不同，初步探討材料細(xì)胞毒性的機(jī)制往往選擇多生物學(xué)終點(diǎn)的評(píng)價(jià)，同時(shí)進(jìn)一步采用分子生物學(xué)方法探明材料的毒性機(jī)理。[13]

MTT試驗(yàn)是一種檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)、存活情況的方法，主要原理是活細(xì)胞中的線粒體琥珀酸脫氫酶將MTT分子還原，產(chǎn)生紫色結(jié)晶物，DMSO溶解紫色結(jié)晶，比色測(cè)定吸光值，呈現(xiàn)材料的浸漬液對(duì)細(xì)胞數(shù)量及活性的影響；[14-15]在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。直接接觸試驗(yàn)是受試樣品直接接觸機(jī)體，可測(cè)出材料微弱的細(xì)胞毒性，對(duì)材料的細(xì)胞毒性敏感性最高；瓊脂覆蓋法以肉眼或電鏡觀察細(xì)胞溶解區(qū)和脫色區(qū)范圍來(lái)直接評(píng)價(jià)材料對(duì)細(xì)胞膜的破壞程度；[16]分子濾過(guò)法則是檢測(cè)生物材料對(duì)活細(xì)胞琥珀酸脫氫酶活性的影響評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性的方法；[17]正常細(xì)胞內(nèi)存在乳酸脫氫酶（LDH），僅于細(xì)胞受損時(shí)裂解釋放至胞外，所以LDH釋放法可檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清的LDH活性評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性。[18-19]上述五種檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)以及適用范圍見表2.

2.2 血液相容性評(píng)價(jià)

植入機(jī)體的生物材料接觸血液時(shí)，機(jī)體血液將產(chǎn)生相關(guān)生理生化反應(yīng)，尤其考察用于心血管體系的生物材料引起的血液生理變化有著特殊意義。因此評(píng)價(jià)生物材料與血液接觸時(shí)對(duì)機(jī)體血液破壞的量度，即血液相容性評(píng)價(jià)。具體指形成血栓、紅細(xì)胞破壞、減少或激活血小板；凝血因子和補(bǔ)體系統(tǒng)是否激活；血液中各種酶活性是否改變；有害免疫反應(yīng)是否發(fā)生等，血液生理生化反應(yīng)是相互聯(lián)系又同時(shí)發(fā)生（如圖1)。[20]心血管體系的生物材料更需要具有非常優(yōu)良的血液相容性。由于內(nèi)環(huán)境理化因子的復(fù)雜性與多變及凝血機(jī)制，因此生物材料需要經(jīng)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行血液相容性評(píng)價(jià)，具體評(píng)價(jià)方法和指標(biāo)還未標(biāo)準(zhǔn)化。[21]血液相容性評(píng)價(jià)一般采用體外實(shí)驗(yàn)、半體內(nèi)試驗(yàn)和體內(nèi)試驗(yàn)。

表2 細(xì)胞毒性檢測(cè)方法[14-19]

在實(shí)驗(yàn)室中模擬體內(nèi)環(huán)境，如溫度、血液接觸生物材料界面的剪切力，檢測(cè)材料接觸血液后的變化，即體外實(shí)驗(yàn)。特點(diǎn)是節(jié)省經(jīng)費(fèi)，周期短，操作簡(jiǎn)單，易控制。

將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物循環(huán)血液導(dǎo)出體外與材料相互作用之后，直接返回體內(nèi)，即半體內(nèi)試驗(yàn)。由于實(shí)驗(yàn)中利用在體循環(huán)血液，免除了抗凝劑制造的假象。

體內(nèi)試驗(yàn)則是將生物材料直接種植于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)一定位置，經(jīng)過(guò)一定的試驗(yàn)時(shí)間后取出材料再進(jìn)行評(píng)價(jià)。相比于體外試驗(yàn)其結(jié)果與臨床應(yīng)用密切相關(guān)。但具有和半體內(nèi)試驗(yàn)相同的缺點(diǎn)——受實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬與個(gè)體間差異的影響，且需大量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

圖1 材料對(duì)血液的作用[20]

2.3 遺傳毒性和致癌試驗(yàn)

體外檢測(cè)遺傳毒性和致癌實(shí)驗(yàn)常用Ames實(shí)驗(yàn)，由細(xì)菌介導(dǎo)的檢測(cè)基因毒物的一種方法，也是檢測(cè)基因突變最常用的方法。由于Ames實(shí)驗(yàn)菌種的變異，致使假陰性率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果由10%增加到30%～40%，[22]因此，需要進(jìn)行體外染色體畸變?cè)囼?yàn)和微核試驗(yàn)相互補(bǔ)充，對(duì)遺傳毒性進(jìn)行科學(xué)評(píng)價(jià)。[2]分子檢測(cè)在遺傳毒性和致癌試驗(yàn)的評(píng)價(jià)中有特殊意義，可取代某些大型動(dòng)物試驗(yàn)（如嚙齒類動(dòng)物）。核酸(DNA、RNA)檢測(cè)技術(shù)，可在基因轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平上研究生物材料對(duì)細(xì)胞的影響。[23]

2.4 植入實(shí)驗(yàn)

植入實(shí)驗(yàn)是材料的生物相容性和安全性評(píng)價(jià)的主要檢測(cè)方法，有兩種方法：皮下植入和骨內(nèi)植入。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的適當(dāng)位置如皮下、肌肉等，埋植生物材料，按照試驗(yàn)時(shí)間定期取材制作組織學(xué)切片觀察組織變化，材料與機(jī)體組織之間的理想反應(yīng)是植入物周圍形成纖維包膜，是材料生物相容性良好的一個(gè)重要指標(biāo)。[24]對(duì)與機(jī)體組織長(zhǎng)期接觸的材料可選皮下植入實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)材料與皮下組織器官的反應(yīng)。選擇同種、同齡、同性別實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，將受試材料與對(duì)照材料分別植入同一部位，試驗(yàn)周期4至12周不等。定期取材評(píng)價(jià)動(dòng)物的生物反應(yīng)，進(jìn)行大體觀察和組織病理學(xué)評(píng)價(jià)。長(zhǎng)期皮下植入外來(lái)生物材料條件下能否引發(fā)機(jī)體組織產(chǎn)生腫瘤是新一代人工器官及生物材料研發(fā)急需解決的問(wèn)題。[25]骨內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)常選實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的左右肢股骨外側(cè)或者脛骨內(nèi)側(cè)作為植入位置，在同一部位的一側(cè)放置受試樣品另一側(cè)放置對(duì)照樣品；另外可選牙槽骨植入。觀察動(dòng)物的反應(yīng)并記錄異常表現(xiàn)，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)植入體周圍組織進(jìn)行生物評(píng)價(jià)。[26]

2.5 過(guò)敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)

過(guò)敏實(shí)驗(yàn)中必須設(shè)立陰性對(duì)照組，遵循隨機(jī)化原則分組。[2]以腹腔注射途徑給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物浸提液處理，觀察動(dòng)物的生理反應(yīng)，特別觀察末次注射后的變化，如用爪搔鼻、噴嚏、豎毛、抽搐、呼吸困難、尿便失禁、休克、死亡等反應(yīng)。

3 展 望

生物醫(yī)用材料生物相容性的評(píng)價(jià)研究是長(zhǎng)期需要關(guān)注并不斷更新發(fā)展的領(lǐng)域，是生物醫(yī)用材料安全應(yīng)用于人體的前提與根本保障。以現(xiàn)代分子生物學(xué)的方法檢測(cè)生物醫(yī)用材料的安全性是必然手段。[27]盡管對(duì)生物醫(yī)用材料生物相容性的評(píng)價(jià)引入了分子方法，由于生物醫(yī)用材料種類多樣并用途不同，其檢測(cè)方法也是多樣的，因此評(píng)價(jià)方法尚未形成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。相信隨著生命科學(xué)整體研究水平的發(fā)展與創(chuàng)新，將會(huì)有更多精準(zhǔn)的研究手段和多樣化的檢測(cè)方法涌現(xiàn)，促使生物醫(yī)用材料的評(píng)價(jià)研究從整體與器官水平實(shí)現(xiàn)向細(xì)胞與分子水平的跨越，并將在分子水平建立綜合的生物相容性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)體系，為開發(fā)出重建與修復(fù)功能優(yōu)越的生物醫(yī)用材料提供研究方向。

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