談?wù)剫胗變号浞矫追壑衼喯跛猁}的檢測

林旭彬

（廣東東泰乳業(yè)有限公司，廣東 揭陽 515500）

0 前言

嬰幼兒配方米粉是將大米磨成粉，加入奶粉、白砂糖、維生素、微量元素等輔料經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化、酶解、輥筒烘干、粉碎、裝罐制成的，是一種嬰幼兒谷類輔助食品。嬰幼兒配方米粉產(chǎn)品的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為GB10769—2010（食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒谷類輔助食品）；污染物限量指標(biāo)項目亞硝酸鹽在GB10769—2010 標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定采用GB5009.33—2010（食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定）進(jìn)行檢測，在GB 5009.33—2010 中第一法離子色譜法由于設(shè)備原因，大部分檢驗機(jī)構(gòu)都采用第二法分光光度法和第三法乳及乳制品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定；再由于嬰幼兒配方米粉產(chǎn)品不是乳制品，因此大部分檢驗機(jī)構(gòu)都采用GB5009.33—2010 中的第二法分光光度法。下面是GB 5009.33—2010 中第二法分光光度法和第三法乳及乳制品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定法的檢測。

1 實驗部分

本實驗所用本方法所用試劑均為分析純。水為GB/T 6682 規(guī)定的二級水或去離子水。

1.1 分光光度法

1.1.1 原理

試樣經(jīng)沉淀蛋白質(zhì)、除去脂肪后，在弱酸條件下亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸重氮化后，再與鹽酸萘乙二胺偶合形成紫紅色染料，外標(biāo)法測得亞硝酸鹽含量。

1.1.2 試劑與設(shè)備

1）試劑及配制

（1）亞鐵氰化鉀（K4Fe(CN)6·3H2O）。

（2）乙酸鋅（Zn(CH3COO)2·2H2O）。

（3）冰醋酸（CH3COOH）。

（4）硼酸鈉（Na2B4O7·10H2O）。

（5）鹽酸（ρ＝1.19 g/mL）。

（6）氨水（25 %）。

（7）對氨基苯磺酸(C6H7NO3S）。

（8）鹽酸萘乙二胺(C12H14N2·2HCl）。

（9）亞硝酸鈉（NaNO2）。

（10）硝酸鈉（NaNO3）。

（11）鋅皮或鋅棒。

（12）硫酸鎘。

（13）亞鐵氰化鉀溶液(106g/L)：稱取106.0 g 亞鐵氰化鉀，用水溶解，并稀釋至1000 mL。

（14）乙酸鋅溶液(220g/L)：稱取220.0 g 乙酸鋅，先加30mL 冰醋酸溶解，用水稀釋至1000mL。

（15）飽和硼砂溶液(50g/L)：稱取5.0 g 硼酸鈉，溶于100mL 熱水中，冷卻后備用。

（16）氨緩沖溶液（pH9.6～9.7）：量取30mL 鹽酸，加100mL 水，混勻后加65mL 氨水，再加水稀釋至1000mL，混勻。調(diào)節(jié)pH 至9.6～9.7。

（17）氨緩沖液的稀釋液：量取50mL 氨緩沖溶液，加水稀釋至500 mL，混勻。

（18）鹽酸(0.1mol/L)：量取5mL 鹽酸，用水稀釋至600mL。

（19）對氨基苯磺酸溶液（4g/L）：稱取0.4g 對氨基苯磺酸，溶 于100 mL 20 %（V/V）鹽酸中，置棕色瓶中混勻，避光保存。

（20）鹽酸萘乙二胺溶液（2g/L）：稱取0.2g 鹽酸萘乙二胺，溶 于100mL 水中，混勻后，置棕色瓶中，避光保存。

（21）亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（200μg/mL）：準(zhǔn)確稱取0.1000g 于115℃干燥恒重的亞硝酸鈉，加水溶解移入500mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。

（22）亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液（5.0μg/mL）：臨用前，吸取亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液5.00mL，置于200mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度。

（23）硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（200μg/mL，以亞硝酸鈉計）：準(zhǔn)確稱取0.1232g 于115℃干燥恒重的硝酸鈉，加水溶解，移于入500mL 容量瓶中，并稀釋至刻度。

（24）硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液（5μg/mL）：臨用時吸取硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液2.50mL，置于100mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度。

2）設(shè)備

天平（感量為0.1mg 和1mg）、組織搗碎機(jī)、超聲波清洗器、恒溫干燥箱、分光光度計、鎘柱

3）試樣預(yù)處理

將試樣裝入能夠容納2 倍試樣體積的帶蓋容器中，通過反復(fù)搖晃和顛倒容器使樣品充分混勻直到使試樣均一化。

1.1.3 試樣處理

1）提取

稱取5g（精確至0.01g）制成勻漿的試樣（如制備過程中加水，應(yīng)按加水量折算），置于50mL 燒杯中，加12.5mL 飽和硼砂溶液，攪拌均勻，以70 ℃左右的水約300mL 將試樣洗入500mL 容量瓶中，于沸水浴中加熱15min，取出置冷水浴中冷卻，并放置至室溫。

2）提取液凈化

在振蕩上述提取液時加入5mL 亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，再加入5mL 乙酸鋅溶液，以沉淀蛋白質(zhì)。加水至刻度，搖勻，放置30min，除去上層脂肪，上清液用濾紙過濾，棄去初濾液30mL，濾液備用，同時做試劑空白。

3）亞硝酸鹽的測定

①標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制；取標(biāo)準(zhǔn)溶液（亞硝酸根NO2-）0.50 mL 于100mL 的容量瓶中定容，分別吸取0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、1.00mL、2.00mL 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液于50mL 比色管中，加入2mL 對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3min 后各加入1mL 鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混勻，靜置15min，用2cm 比色杯，以零管調(diào)零，于波長538nm 處測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

②吸取40.0mL 上述濾液于置于50mL 帶塞比色管中。于標(biāo)準(zhǔn)管與試樣管中分別加入2mL 對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3min 后各加入1mL 鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混勻，靜置15min，用2cm比色杯，以試劑空白管調(diào)零，于波長538nm 處測吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線讀數(shù)。按公式計算含量。

1.2 乳及乳制品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定

1.2.1 原理

試樣經(jīng)沉淀蛋白質(zhì)、除去脂肪后，用鍍銅鎘粒使部分濾液中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。在濾液和已還原的濾液中，加入磺胺和N-1-萘基-乙二胺二鹽酸鹽，使其顯粉紅色，然后用分光光度計在538 nm 波長下測其吸光度。將測得的吸光度與亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的吸光度進(jìn)行比較，就可計算出樣品中的亞硝酸鹽含量。

1.2.2 試劑與設(shè)備

1）試劑及配制

測定用水應(yīng)是不含硝酸鹽和亞硝酸鹽的蒸餾水或去離子水

（1）亞硝酸鈉（NaNO2）。

（2）硝酸鉀（KNO3）。

（3）鍍銅鎘柱

鎘粒直徑0.3mm～0.8mm。也可按下述方法制備。將適量的鋅棒放入燒杯中，用40g/L 的硫酸鎘（CdSO4·8H2O）溶液浸沒鋅棒。在24 h 之內(nèi)，不斷將鋅棒上的海綿狀鎘刮下來。取出鋅棒，潷出燒杯中多余的溶液，剩下的溶液能浸沒鎘即可。用蒸餾水沖洗海綿狀鎘2 次，然后把鎘移入小型攪拌器中，同時加入400mL 0.1mol/L 的鹽酸。攪拌幾秒鐘，以得到所需粒度的顆粒。將攪拌器中的鎘粒連同溶液一起倒回?zé)校o置幾小時，這期間要攪拌幾次以除掉氣泡。傾出大部分溶液，立即鍍銅。

（4）硫酸銅溶液：溶解20 g 硫酸銅（CuSO4·5H2O）于水中，稀釋至1000 mL。

（5）鹽酸-氨水緩沖溶液：pH 9.60～9.70。用600mL 水稀釋75mL濃鹽酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36%～38%）?；靹蚝?，再加入135mL 濃氨水（質(zhì)量分?jǐn)?shù)等于25 %的新鮮氨水）。用水稀釋至1000mL，混勻。用精密pH計調(diào)pH 值為9.60～9.70。

（6）鹽酸(2mol/L)：160mL 的濃鹽酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36%～38%）用水稀釋至1000mL。

（7）鹽酸（0.1mol/L）：50mL 2mol/L 的鹽酸用水稀釋至1000mL。

（8）沉淀蛋白和脂肪的溶液：

①硫酸鋅溶液：將53.5g 的硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）溶于水中，并稀釋至100 mL。

②亞鐵氰化鉀溶液：將17.2g 的三水亞鐵氰化鉀[K4Fe(CN)6·3H2O]溶于水中，稀釋至100mL。

（9）EDTA溶液：用水將33.5g的乙二胺四乙酸二鈉（Na2C10H14N2O3·2H2O）溶解，稀釋至1000 mL。

（10）顯色液1：體積比為450:550 的鹽酸。將450mL 濃鹽酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36 %～38 %）加入到550mL 水中，冷卻后裝入試劑瓶中。

（11）顯色液2：5g/L 的磺胺溶液。在75mL 水中加入5mL 濃鹽酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36 %～38 %），然后在水浴上加熱，用其溶解0.5g 磺胺（NH2C6H4SO2NH2）。冷卻至室溫后用水稀釋至100mL。必要時進(jìn)行過濾。

（12）顯色液3 ：1 g/L 的萘胺鹽酸鹽溶液。將0.1 g 的N-1-萘基-乙二胺二鹽酸鹽（C10H7NHCH2CH2NH2·2HCl）溶于水，稀釋至100 mL。必要時過濾。

（13）亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液：相當(dāng)于亞硝酸根的濃度為0.001 g/L。

將亞硝酸鈉在115 ℃的范圍內(nèi)干燥至恒重。冷卻后稱取0.150g，溶于1000 mL 容量瓶中，用水定容。在使用的當(dāng)天配制該溶液。取10mL 上述溶液和20mL 緩沖溶液于1000mL 容量瓶中，用水定容。每1mL 該標(biāo)準(zhǔn)溶液中含1.00 μg 的NO2

（14）硝酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)于硝酸根的濃度為0.0045 g/L。

將硝酸鉀在115℃的溫度范圍內(nèi)干燥至恒重，冷卻后稱取1.4580 g，溶于1000mL 容量瓶中，用水定容。在使用當(dāng)天，于1000mL 的容量瓶中，取5mL 上述溶液和20mL 緩沖溶液，用水定容。每1 mL 的該標(biāo)準(zhǔn)溶液含有4.50μg 的NO3

2）設(shè)備

所有玻璃儀器都要用蒸餾水沖洗，以保證不帶有硝酸鹽和亞硝酸鹽。

（1）天平：感量為0.1 mg 和1 mg。

（2）燒杯：100 mL。

（3）錐形瓶：250 mL，500 mL。

（4）容量瓶：100 mL、500 mL 和1000 mL。

（5）移液管：2 mL、5 mL、10 mL 和20 mL。

（6）吸量管：2 mL、5 mL、10 mL 和25 mL。

（7）量筒：根據(jù)需要選取。

（8）玻璃漏斗：直徑約9 cm，短頸。

（9）定性濾紙：直徑約18 cm。

（10）還原反應(yīng)柱：簡稱鎘柱。

（11）分光光度計：測定波長538 nm，使用1cm～2cm 光程的比色皿。

（12）pH 計：精度為±0.01，使用前用pH7 和pH9 的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校正。

3）分析步驟

（1）制備鍍銅鎘柱

①置鎘粒于錐形瓶中（所用鎘粒的量以達(dá)到要求的鎘柱高度為準(zhǔn)）。

②加足量的鹽酸以浸沒鎘粒，搖晃幾分鐘。

③潷出溶液，在錐形燒瓶中用水反復(fù)沖洗，直到把氯化物全部沖洗掉。

④在鎘粒上鍍銅。向鎘粒中加入硫酸銅溶液（每克鎘粒約需2.5 mL），振蕩1 min。

⑤潷出液體，立即用水沖洗鍍銅鎘粒，注意鎘粒要始終用水浸沒。當(dāng)沖洗水中不再有銅沉淀時即可停止沖洗。

⑥在用于盛裝鍍銅鎘粒的玻璃柱的底部裝上幾厘米高的玻璃纖維。在玻璃柱中灌入水，排凈氣泡。

⑦將鍍銅鎘粒盡快地裝入玻璃柱，使其暴露于空氣的時間盡量短。鍍銅鎘粒的高度應(yīng)在15cm～20cm 的范圍內(nèi)。注1：避免在顆粒之間遺留空氣。注2：注意不能讓液面低于鍍銅鎘粒的頂部。

⑧新制備柱的處理。將由750mL 水、225mL 硝酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液、20mL緩沖溶液和20mLEDTA 溶液組成的混合液以不大于6mL/min 的流量通過剛裝好鎘粒的玻璃柱，接著用50mL 水以同樣流速沖洗該柱。

（2）檢查柱的還原能力

①用移液管將20mL 的硝酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液移入還原柱頂部的貯液杯中，再立即向該貯液杯中添加5mL 緩沖溶液。用一個100mL 的容量瓶收集洗提液。洗提液的流量不應(yīng)超過6mL/min。

②在貯液杯將要排空時，用約15mL 水沖洗杯壁。沖洗水流盡后，再用15mL 水重復(fù)沖洗。當(dāng)?shù)诙螞_洗水也流盡后，將貯液杯灌滿水，并使其以最大流量流過柱子。

③當(dāng)容量瓶中的洗提液接近100mL 時，從柱子下取出容量瓶，用水定容至刻度，混合均勻。

④移取10mL 洗提液于100mL 容量瓶中，加水至60mL 左右。

⑤根據(jù)測得的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查得稀釋洗提液中的亞硝酸鹽含量（μg/mL）。據(jù)此可計算出以百分率表示的柱還原能力（NO-的含量為0.067μg/mL 時還原能力為100%）。如果還原能力小于95%，柱子就需要再生。

（3）樣品的稱取和溶解

①嬰幼兒配方米粉樣品：在100mL 燒杯中稱取10g 樣品，準(zhǔn)確至0.001g。用112mL 52 ℃的水將樣品洗入500 mL 錐形瓶中，混勻。用鋁箔紙蓋好錐形瓶口，將溶好的樣品在沸水中煮15min，然后冷卻至約50 ℃。

（4）脂肪和蛋白質(zhì)的去除

①按順序加入24mL 硫酸鋅溶液、24mL 亞鐵氰化鉀溶液和40 mL 緩沖溶液，加入時要邊加邊搖，每加完一種溶液都要充分搖勻。

②靜置1 h。然后用濾紙過濾，濾液用250mL 錐形瓶收集。

（5）硝酸鹽還原為亞硝酸鹽

①移取20mL 濾液于100mL 小燒杯中，加入5mL 緩沖溶液，搖勻，倒入鎘柱頂部的貯液杯中，以小于6mL/min 的流速過柱。洗提液（過柱后的液體）接入100mL 容量瓶中。

②當(dāng)貯液杯快要排空時，用15mL 水沖洗小燒杯，再倒入貯液杯中。沖洗水流完后，再用15mL 水重復(fù)一次。當(dāng)?shù)诙螞_洗水快流盡時，將貯液杯裝滿水，以最大流速過柱。

③當(dāng)容量瓶中的洗提液接近100mL 時，取出容量瓶，用水定容，混勻。

（6）測定

①分別移取20mL 洗提液和20mL 濾液于100mL 容量瓶中，加水至約60mL。

②在每個容量瓶中先加入6mL 顯色液1，邊加邊混；再加入5mL顯色液2。小心混合溶液，使其在室溫下靜置5min，避免直射陽光。

③加入2mL 顯色液3，小心混合，使其在室溫下靜置5min，避免直射陽光。用水定容至刻度，混勻。

④在15min 內(nèi)用538nm 波長，以空白試驗液體為對照測定上述樣品溶液的吸光度。

（7）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

①分別移?。ɑ蛴玫味ü芊?出）0mL、2mL、4mL、6mL、10mL、12 mL、16mL 和20mL 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液于9 個100mL 容量瓶中。在每個容量瓶中加水，使其體積約為60 mL。

②在每個容量瓶中先加入6mL 顯色液1，邊加邊混；再加入5mL顯色液2。小心混合溶液，使其在室溫下靜置5min，避免直射陽光。

③加入2mL 顯色液3，小心混合，使其在室溫下靜置5min，避免直射陽光。用水定容至刻度，混勻。

④在15min 內(nèi)，用538nm 波長，以第一個溶液（不含亞硝酸鈉）為對照測定另外八個溶液的吸光度。

⑤將測得的吸光度對亞硝酸根質(zhì)量濃度作圖。亞硝酸根的質(zhì)量濃度可根據(jù)加入的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的量計算出。亞硝酸根的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)。亞硝酸根的質(zhì)量濃度以μg/100mL 表示。

（8）按公式計算含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩種方法測定結(jié)果比較

取5 個不同樣品，分別采用分光光度法和乳及乳制品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定法進(jìn)行檢測。結(jié)果見表1。

表1

從上表數(shù)值可以發(fā)現(xiàn)2 種方法檢測結(jié)果最小相差2.45%，最大的相差2.56%，誤差很大，因嬰幼兒配方米粉的亞硝酸鹽的限量為不超過2mg/kg，從上面的5 個檢測數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)：采用分光光度法檢測的結(jié)果全部超過2mg/kg，產(chǎn)品全部超標(biāo)，嚴(yán)重影響亞硝酸鹽項目的準(zhǔn)確性。

2.2 用GB 5009.33—2010 的第一法離子色譜法和第三法乳及乳制品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定法比較見表2。

從表2 數(shù)值可以看出，用第一法離子色譜法和第三法乳及乳制品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定法的檢測結(jié)果是十分接近。

2.3 討論

用GB 5009.33—2010 中第二法分光光度法檢測嬰幼兒配方米粉，由于米粉中含有淀粉，并且蛋白質(zhì)的含量較高（含量都超過7%），造成樣品處理后的溶液比較渾濁，用比色法來確定亞硝酸鹽的含量存在很大的誤差，檢驗結(jié)果不能真實反映產(chǎn)品實際含有亞硝酸鹽的含量；雖然在實際工作中會加入淀粉酶進(jìn)行酶解，使處理后的溶液澄清，但由于沒有加入的標(biāo)準(zhǔn)，淀粉酶的加多加少會影響檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，檢驗結(jié)果存在很大誤差。用GB 5009.33—2010 中第三法 乳及乳制品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定法來檢測，由于該方法是針對乳制品設(shè)置的檢驗方法，特別是針對蛋白質(zhì)和脂肪含量較高的食品，檢驗過程采用比較多的沉淀劑，使樣品處理后的溶液比較澄清，從而大大的減少比色過程中帶來的誤差，保證檢測結(jié)果的正確性。

表2

因此中嬰幼兒配方米粉中亞硝酸鹽含量的檢測方法不能選用GB 5009.33—2010 中第二法分光光度法進(jìn)行檢測。

［1］GB 10769—2010 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)：嬰幼兒谷類輔助食品[S].

［2］GB 5413.5-2010 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)：食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定[S].

［3］廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院出具的編號為食許2013-05-0181 檢驗報告[R].