雙酶分步酶解制備玉米多肽

黃 薇，宋永康，田寶玉，余 華

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室/福建省精密儀器農(nóng)業(yè)測(cè)試重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州350003;2.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/工業(yè)微生物教育部工程研究中心，福州350108)

玉米蛋白粉是玉米淀粉加工中的副產(chǎn)物，其蛋白質(zhì)含量一般在50%以上[1].玉米蛋白主要由醇溶蛋白(60% －68%)和谷蛋白(22% －28%)組成，是一種價(jià)格低廉的植物蛋白質(zhì).玉米蛋白質(zhì)中亮氨酸、丙氨酸、異亮氨酸等疏水性氨基酸和脯氨酸、谷氨酸的比例較高，而組氨酸、賴氨酸、色氨酸等氨基酸比例偏低，使得玉米蛋白質(zhì)水溶性差、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不高，在食品與飼料中的應(yīng)用受到限制[2－3].但這種獨(dú)特的氨基酸組成也使得玉米蛋白質(zhì)成為各種生理活性肽的來(lái)源.有研究表明[4－5]，玉米蛋白粉經(jīng)蛋白酶水解后，具有許多獨(dú)特的生理活性，包括抗氧化性、消除疲勞、解酒保肝、降血壓等.因此玉米肽資源也受到食品工業(yè)和飼料工業(yè)的廣泛關(guān)注.

如何在較短時(shí)間內(nèi)利用玉米蛋白制備高得率的玉米活性肽是目前玉米肽生產(chǎn)工藝中急需解決的技術(shù)問(wèn)題.張宇昊[6]在花生蛋白Alcalase酶水解的研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用N120P酶水解花生蛋白，所得多肽得率為89.01%，比Alcalase酶單獨(dú)酶解提高13.90%.林虬等[7]采用Alcalase水解蛋白酶和Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶對(duì)棉籽蛋白進(jìn)行雙酶分步水解，最終水解產(chǎn)物的多肽得率可達(dá)到71.32%，比單獨(dú)應(yīng)用Alcalase水解蛋白酶，多肽得率提高5.88%.宋永康等[8]研究Alcalase蛋白酶和Protex.7L蛋白酶對(duì)豆粕蛋白的酶解作用，結(jié)果表明采用雙酶分步接力水解達(dá)到的多肽得率高于雙酶同步水解和單酶水解.由此可見，相比單酶水解，雙酶分步水解可以顯著提高酶解過(guò)程中的多肽得率[6－8].本研究以玉米蛋白粉為原料，以多肽得率為指標(biāo)，在采用Alcalase酶水解玉米蛋白的基礎(chǔ)上，篩選出合適蛋白酶繼續(xù)酶解玉米蛋白Alcalase酶解物制備玉米活性肽，并對(duì)繼續(xù)酶解的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，探索出分步酶水解玉米蛋白的最適工藝條件，制備出多肽得率較高的玉米蛋白酶解產(chǎn)物，為玉米肽產(chǎn)業(yè)化提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米蛋白粉(粗蛋白含量52.81%)購(gòu)于福州科匯生物技術(shù)有限公司;三氯乙酸、甲醛、氫氧化鈉、鹽酸等試劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;試驗(yàn)用Alcalase酶、Protamex酶、Flavourzyme酶、Protex.7L酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶(表1).

表1 試驗(yàn)用蛋白酶的活力及性質(zhì)1)Table 1 Activities and action conditions of several protein enzymes

1.2 主要設(shè)備

Kjeltec 2300自動(dòng)定氮儀:瑞典Foss有限公司;KQ-250DB臺(tái)式數(shù)控超聲儀:蘇州江東精密儀器有限公司;TD5A-WS離心機(jī):長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;HJ-3恒溫磁力攪拌器、3HA-C恒溫振蕩器:常州國(guó)華電器有限公司;PHS-3C pH酸度計(jì):上海精密科學(xué)儀器有限公司.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 玉米蛋白預(yù)處理試驗(yàn) 按比例稱取一定量玉米蛋白粉，加水混勻，調(diào)節(jié)溶液pH值為11，在頻率40 kHz、功率45 W和溫度60℃中超聲30 min，作為酶反應(yīng)的底物溶液.

1.3.2 Alcalase酶對(duì)玉米蛋白的酶解 按底物濃度100.0 g·L－1配制酶反應(yīng)底物溶液，調(diào)節(jié)底物溶液pH至9.0，按加酶量(2830 U·g－1)加入Alcalase酶，在反應(yīng)溫度58.0℃進(jìn)行酶解，酶解時(shí)間為180 min;95℃水浴滅酶15 min，待用.在該條件下制備的玉米酶解產(chǎn)物的多肽得率為(46.61±0.37)%[9].

1.3.3 分步水解用蛋白酶的篩選試驗(yàn) 在玉米蛋白Alcalase酶水解的基礎(chǔ)上，按表1所示最適反應(yīng)溫度和pH值調(diào)節(jié)水解液的溫度、pH值，分別加入其他不同蛋白酶1000 U·g－1進(jìn)行水解反應(yīng)，水解時(shí)間180 min，每隔30 min取樣，測(cè)定水解玉米蛋白過(guò)程中的多肽得率的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì).

1.3.4 多肽得率的測(cè)定 多肽得率采用三氯乙酸可溶性氮法進(jìn)行測(cè)定[10]，其計(jì)算公式為:多肽得率/%=(15%TCA酸溶蛋白含量－游離氨基酸含量)/總蛋白×100.

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)Alcalase酶水解玉米蛋白的最適工藝條件、Protex.7L酶說(shuō)明書推薦的作用條件及Protex.7L酶水解玉米蛋白過(guò)程中多肽得率的變化規(guī)律，固定反應(yīng)的底物濃度100.0 g·L－1、水解時(shí)間為60 min.選取加酶量X1、反應(yīng)pH值X2、反應(yīng)溫度X3為自變量，運(yùn)用Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[11]，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)(表2).

1.4 數(shù)據(jù)處理

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果采用Design Expert 8.0進(jìn)行極差和方差分析.

表2 響應(yīng)面優(yōu)化的因素和水平設(shè)計(jì)Table 2 Factors and levels of Box-Behnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶分步水解對(duì)酶解效果的影響

由圖1可以看出，在同等酶活力條件下，Protex.7L酶水解產(chǎn)物的多肽得率最高，依次是Protex.7L酶＞胰蛋白酶＞Flavourzyme酶＞木瓜蛋白酶＞Protamex酶.對(duì)水解時(shí)間為180 min的多肽得率結(jié)果進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)表明，5種不同蛋白酶對(duì)玉米蛋白Alcalase酶水解物繼續(xù)水解的效果存在顯著差異.其中，Protex.7L酶水解產(chǎn)物的多肽得率最高(180 min可以達(dá)到 56.55%)，且 Protex.7L 酶水解玉米蛋白的反應(yīng)速度比其他蛋白酶快，最先達(dá)到水解平衡.因此，為了在短時(shí)間內(nèi)獲得較高的玉米多肽得率，在實(shí)際生產(chǎn)中選擇Protex.7L酶作為制備玉米多肽的繼續(xù)水解蛋白酶.

圖1 玉米蛋白酶解過(guò)程中多肽得率的變化Fig.1 Dynamic changes in yield of peptides during hydrolysis of corn gluten meal

2.2 酶解工藝條件優(yōu)化

2.2.1 多元二次回歸方程的建立與分析 選取加酶量(X1)、反應(yīng)pH值(X2)、反應(yīng)溫度(X3)為自變量，以多肽得率(Y)為響應(yīng)值，開展三因素三水平、N=17的Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)(表3).對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到多肽得率擬合回歸方程為:

表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)矩陣和響應(yīng)數(shù)據(jù)的實(shí)測(cè)值與擬合值Table 3 Test scheme and its observation and simulation values in Box-Behnken design

響應(yīng)面回歸模型方差分析見表4.結(jié)果表明，所得二次多項(xiàng)模型極顯著(P值＜0.0001)，失擬項(xiàng)P值=0.2648不顯著，表明該回歸模型為理想模型.多元相關(guān)系數(shù)為R2=0.9940，校正決定系數(shù)Adj R2=0.9863，說(shuō)明此回歸模型能解釋98.63%響應(yīng)值的變異;模型的信噪比(Adeq precision)為28.1333(＞4)，顯示本模型擬合3個(gè)因數(shù)與響應(yīng)值之間的關(guān)系是可行的.根據(jù)3因素對(duì)酶解產(chǎn)物的多肽得率的影響，回歸方程的一次項(xiàng)X1、X3對(duì)多肽得率影響極顯著，X2對(duì)多肽得率影響顯著，且影響順序?yàn)閄3＞X1＞X2，二次項(xiàng)X21、X22、X23以及交互項(xiàng)中X2X3也對(duì)多肽得率有顯著影響，表明多肽得率的變化比較復(fù)雜，各試驗(yàn)因素對(duì)多肽得率的影響不是呈簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而是呈二次關(guān)系，且3因素之間存在交互作用.

表4 二次多項(xiàng)模型方差分析表1)Table 4 Analysis of variance for the regression quadratic model equation of Box-Behnken design

2.2.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化 將模型中的加酶量X1、反應(yīng)pH值X2、反應(yīng)溫度X3中的其中1個(gè)因素固定在0水平，得到另外2個(gè)因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值Y的子模型，根據(jù)模型分別繪制響應(yīng)曲面圖及等高線圖(圖2).結(jié)果表明，固定 X3=45 ℃，在 X1=1099.71 U·g－1、X2=7.57 時(shí)，多肽得率 Y 值達(dá)到最大值55.9538%;固定 X2=7.5，在 X1=1088.59 U·g－1、X3=42.11 ℃時(shí)，Y 值最大為 56.3878%;固定 X1=1000 U·g－1、X2=7.60、X3=41.99 ℃時(shí)，Y 值達(dá)到最大值 56.3506%，且 3 因素與多肽得率均呈拋物線關(guān)系，隨著各因素值的增加，多肽得率呈現(xiàn)先增大后減小的變化趨勢(shì)，在單因素增至特定范圍內(nèi)達(dá)到極大值.

圖2 酶解產(chǎn)物多肽得率的等高線圖及響應(yīng)面圖Fig.2 Contour lines and response surface of the yield of peptides

2.2.3 優(yōu)化工藝參數(shù)的確定與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 利用Design-Expert 8.0軟件分析，得到Protex.7L酶繼續(xù)酶解的最優(yōu)工藝參數(shù)為加酶量 1090.33 U·g－1、pH 值7.61、反應(yīng)溫度 42.03 ℃，多肽得率為 56.4182%.考慮到成本及實(shí)際操作方便，選擇Protex.7L酶繼續(xù)酶解玉米蛋白的工藝條件為加酶量1090 U·g－1、反應(yīng)pH值7.6、反應(yīng)溫度42.0℃，在該條件下所得的多肽得率預(yù)測(cè)值為56.4179%.在上述優(yōu)化的酶解工藝條件下，做3組平行試驗(yàn)進(jìn)行模型驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)測(cè)玉米多肽得率的結(jié)果分別為56.12%、56.48%和56.23%，與預(yù)測(cè)值的誤差在±1%以內(nèi)，比Alcalase酶單獨(dú)作用提高21.05%.

3 結(jié)論

(1)對(duì)Flavourzyme酶、木瓜蛋白酶、Protamex酶、Protex.7L酶、胰蛋白酶等5種不同商業(yè)化蛋白酶繼續(xù)水解玉米蛋白Alcalase酶水解物的多肽得率變化規(guī)律進(jìn)行分析.其中Protex.7L酶繼續(xù)酶解生成的多肽得率最高，故選用Protex.7L酶作為繼續(xù)水解玉米蛋白制備玉米多肽的蛋白酶.

(2)采用響應(yīng)面分析法對(duì)Protex.7L酶繼續(xù)水解玉米蛋白的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化.結(jié)果表明，所建立的響應(yīng)面回歸模型擬合度好、誤差小、可信;加酶量(X1)、底物濃度(X2)及反應(yīng)溫度(X3)對(duì)響應(yīng)值多肽得率均有極顯著的影響，且存在交互作用;確定Protex.7L酶繼續(xù)水解玉米蛋白Alcalase酶水解產(chǎn)物的最佳工藝條件為:加酶量1090 U·g－1、反應(yīng) pH值7.6、反應(yīng)溫度42.0℃，在該條件下最終體系多肽得率為(56.28±0.18)%，與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差在±1%以內(nèi)，比單獨(dú)應(yīng)用Alcalase酶提高了21.05%.

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