鬼針草抑菌物質(zhì)提取及抑菌活性研究

滕 蓉，李清祿，張溫玲

(1.福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建福州350001;2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州350002;3.福州出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建 福州350001)

隨著人們生活水平的提高，追求天然、健康的消費(fèi)理念逐步深入，對(duì)食品的安全水平也提出了更高的要求.傳統(tǒng)化學(xué)防腐劑的使用受到挑戰(zhàn)，開發(fā)高效、安全、無(wú)毒的天然食品防腐劑已成為當(dāng)前食品領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一.由于自然選擇和對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性，眾多植物具有很好的抑菌效果，以植物中提取的抑菌物質(zhì)作為食品防腐劑具有廣闊的發(fā)展前景.

鬼針草(Bidens bipinnata L.)是菊科(Compositae)鬼針草屬(Bidens)植物，也叫鬼釵草、一把針、引線包等，常見(jiàn)于熱帶及溫帶地區(qū)，分布廣泛.鬼針草具有清熱、解毒、消腫的功效，可全草入藥.研究顯示，鬼針草含有黃酮類、多炔類、有機(jī)酸及酯類、苷類、甾醇類和香豆素類等多種活性成分，有降血壓、降血糖、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等藥理作用，還有抑菌活性[1－2].據(jù)報(bào)道，鬼針草的水煎劑可抗堪薩斯分枝桿菌[3]，鬼針草的乙醇浸液對(duì)金黃色葡萄球菌、黑根霉菌、鏈格孢菌及灰葡萄孢菌均有抑制作用[4].但是，目前有關(guān)鬼針草抑菌物質(zhì)的提取工藝尚未見(jiàn)報(bào)道.因此，本文研究鬼針草抑菌物質(zhì)的提取工藝及抑菌活性，為鬼針草作為新型天然防腐劑的開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鬼針草藥材購(gòu)于福州中源藥店，干燥全草，研碎成粗粉，保存于干燥器中備用.供試菌種:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、大腸桿菌(Escherichia coli)由福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供.荔枝疫霉(Peronophythora litchii)、水稻紋枯(Rhizoctonia solani)、稻瘟菌(Magnaporthe grisea)由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供.細(xì)菌采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，真菌采用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA).

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鬼針草提取液的制備 稱取鬼針草粗粉10 g，裝入500 mL圓底燒瓶中，用95%乙醇回流提取，試驗(yàn)條件為料液比1∶10、溫度70℃、回流1次(2 h)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓回收溶劑，蒸發(fā)皿水浴鍋上濃縮，然后60℃真空干燥，制得鬼針草醇提物，備用.

1.2.2 菌液的準(zhǔn)備 (1)菌種的活化.用劃線法將供試標(biāo)準(zhǔn)菌株(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌)分別接入營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，放入培養(yǎng)箱中，37℃ 下培養(yǎng)24 h.荔枝疫霉、水稻紋枯、稻瘟菌等真菌分別接入PDA培養(yǎng)基斜面上，放入培養(yǎng)箱中，28℃下培養(yǎng)24－48 h.

(2)菌液制備.挑取活化好的菌落，用無(wú)菌生理鹽水10倍稀釋法制得不同稀釋濃度的菌懸液，通過(guò)菌落計(jì)數(shù)法制得1×106－1×107CFU·mL－1的菌懸液.

1.2.3 提取物對(duì)細(xì)菌抑制效力的測(cè)定——濾紙片法[5－6]將已滅菌烘干的直徑為5 mm的圓濾紙片，在質(zhì)量濃度為0.2 g·mL－1的鬼針草提取液中浸泡2 h后取出，晾干.將各濃度的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌菌懸液各50 μL加入平皿培養(yǎng)基中，涂布均勻.用鑷子夾取已制備好的鬼針草提取物濾紙片并平貼在含菌培養(yǎng)基上，每個(gè)平板均勻放3片，擺成等邊三角形，濾紙片距平皿邊沿均大于1 cm.以浸有相應(yīng)溶劑濾紙片作對(duì)照，每個(gè)菌種做3個(gè)平行.將操作好的平板倒置，37℃恒溫培養(yǎng)24 h.用游標(biāo)卡尺十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，求3次平均值.

1.2.4 提取物對(duì)真菌抑制效力的測(cè)定——生長(zhǎng)速率法[7－10]取1 mL質(zhì)量濃度為0.5 g·mL－1的鬼針草提取物加入100 mL已121℃濕熱滅菌20 min并冷卻至50℃的PDA培養(yǎng)基中，充分搖勻，倒入直徑為60 mm培養(yǎng)皿內(nèi)制成平板.待培養(yǎng)基凝固后，用打孔器取供試真菌菌餅(直徑4 mm)，放在平板中央，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48－72 h，觀察到對(duì)照菌落直徑為培養(yǎng)皿的3/4左右時(shí)，即可測(cè)量結(jié)果.十字交叉法測(cè)菌落直徑，試驗(yàn)重復(fù)3次.

純生長(zhǎng)量/mm=菌落直徑－菌餅直徑

抑菌率/%=對(duì)照組與試驗(yàn)組的純生長(zhǎng)量差/對(duì)照組純生長(zhǎng)量×100

1.2.5 鬼針草抑菌物質(zhì)提取條件優(yōu)化 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以枯草芽孢桿菌抑菌圈直徑大小為指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)，選取乙醇濃度、提取時(shí)間、回流次數(shù)、提取溫度為測(cè)定因素，優(yōu)化鬼針草抑菌成分的提取條件.

1.2.6 最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)的測(cè)定[11]將8支試管編號(hào)，1號(hào)管裝1.8 mL液體培養(yǎng)基，2－8號(hào)管裝液體培養(yǎng)基1 mL.將其高壓滅菌后冷卻，無(wú)菌操作下，在1號(hào)管加入質(zhì)量濃度為1 g·mL－1鬼針草提取物0.2 mL，搖勻后，從1號(hào)管吸取1 mL混合液移入2號(hào)管，依次操作，將鬼針草提取液進(jìn)行一系列對(duì)倍稀釋后，1 －7 號(hào)管中鬼針草提取物濃度依次為100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56 mg·mL－1.7號(hào)管棄去1 mL，以8號(hào)管作對(duì)照.1－8號(hào)管各加入菌懸液0.1 mL，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后，肉眼觀察對(duì)照試管混濁(有細(xì)菌顯著生長(zhǎng))，以澄清(無(wú)肉眼可見(jiàn)菌生長(zhǎng))試驗(yàn)管的最低濃度為鬼針草提取物對(duì)該菌的MIC.1.2.7 鬼針草提取物穩(wěn)定性試驗(yàn)[12](1)提取物對(duì)溫度的穩(wěn)定性.水浴溫度分別調(diào)為20、40、60、80、100℃，將鬼針草醇提物分別置于不同溫度上加熱30 min，另一組在121℃濕熱下加熱30 min，對(duì)照樣品置于室溫下.以枯草芽孢桿菌為指示菌，用濾紙片法測(cè)定處理前后樣品的抑菌狀況，試驗(yàn)重復(fù)3次.

(2)提取物對(duì)酸堿度的穩(wěn)定性.用不同pH的磷酸緩沖液將鬼針草醇提物的pH分別調(diào)節(jié)為6個(gè)梯度:2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，同時(shí)以未添加鬼針草醇提物的緩沖液培養(yǎng)基為空白對(duì)照.以枯草芽孢桿菌為指示菌，用濾紙片法測(cè)定處理前后樣品的抑菌狀況，試驗(yàn)重復(fù)3次.

(3)提取物對(duì)紫外光(UV)的穩(wěn)定性.將鬼針草醇提物置于紫外燈下分別照射5、10、15、20、25、30 min，同時(shí)以未經(jīng)紫外燈照射的鬼針草醇提物為對(duì)照.以枯草芽孢桿菌為指示菌，用濾紙片法測(cè)定處理前后樣品的抑菌狀況，試驗(yàn)重復(fù)3次.

2 結(jié)果與分析

2.1 鬼針草抑菌物質(zhì)的提取工藝

從表1－2可以看出:各因素對(duì)鬼針草抑菌效果的影響從大到小依次為A(乙醇濃度)、B(提取溫度)、C(提取時(shí)間)和D(回流次數(shù)).最優(yōu)水平組合為A3B3C2D1，即用95%乙醇在70℃下提取1次(2 h).在此最佳提取條件下重復(fù)試驗(yàn)3次，測(cè)得對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑為(10.76±0.32)mm，大于正交實(shí)驗(yàn)表中的結(jié)果.

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果Table 1 The orthogonal design table and results

2.2 鬼針草醇提物的抑菌效果

在最佳提取條件下，鬼針草醇提物對(duì)大腸桿菌、稻瘟菌無(wú)抑制作用，0.2 g·mL－1鬼針草醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別為(9.63 ±0.16)、(10.76 ±0.32)mm，說(shuō)明鬼針草醇提物抑制金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌效果較好.0.5 g·mL－1鬼針草醇提物對(duì)水稻紋枯和荔枝疫霉的抑菌率分別為60.4%和31.6%.

2.3 鬼針草醇提物濃度對(duì)抑菌效果的影響

在最佳提取條件下，鬼針草醇提物濃度對(duì)抑菌效果影響顯著(P＜0.05).鬼針草醇提物濃度越大，對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑制效果越強(qiáng).同一濃度鬼針草提取物對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制效果大于金黃色葡萄球菌(表3).

表2 方差分析結(jié)果1)Table 2 The results of variance analysis

表3 鬼針草醇提物濃度對(duì)其抑菌活性的影響1)Table 3 The effect of alcohol extract concentration of B.bipinnata on the antibacterial activities

2.4 MIC 的測(cè)定

由表4可見(jiàn)，鬼針草醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的MIC分別為12.5、6.25 mg·mL－1.

表4 鬼針草醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的MIC1)Table 4 MIC of alcohol extracts of B.bipinnata against S.aureus and B.subtilis

2.5 鬼針草提取物的穩(wěn)定性

2.5.1 溫度對(duì)鬼針草醇提物抑菌活性的影響 結(jié)果(圖1)表明，鬼針草醇提物經(jīng)不同溫度熱處理后，對(duì)枯草芽孢桿菌均能形成明顯的抑菌圈，即使121℃處理20 min，對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌圈平均直徑仍達(dá)到(10.38±0.13)mm.由此可見(jiàn)，溫度對(duì)鬼針草醇提物的抑菌能力沒(méi)有顯著影響(P＞0.05)，說(shuō)明鬼針草醇提物抑菌活性物質(zhì)熱穩(wěn)定性較好.

圖1 不同處理?xiàng)l件對(duì)鬼針草醇提物抑菌活性的影響Fig.1 Effects of different treatments on the antibacterial activities of alcohol extract of B.bipinnata

2.5.2 pH對(duì)鬼針草醇提物抑菌活性的影響 不同pH下鬼針草醇提物對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制能力有顯著差別(P＜0.05).隨著pH的增大，鬼針草醇提物抑菌活性呈先增強(qiáng)后減弱趨勢(shì)，中性偏堿性環(huán)境的抑菌活性比酸性和較強(qiáng)堿性環(huán)境時(shí)強(qiáng).在pH 4－8時(shí)，抑菌圈直徑?jīng)]有顯著差異(P＞0.05)，鬼針草醇提物對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制活性較強(qiáng)且穩(wěn)定性較好(圖1).

2.5.3 UV對(duì)鬼針草醇提物抑菌活性的影響 不同紫外光照時(shí)間下，鬼針草醇提物對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑波動(dòng)范圍很小，且不存在規(guī)律性，說(shuō)明紫外光照對(duì)其抑菌能力沒(méi)有顯著影響(P＞0.05).由此可見(jiàn)，鬼針草醇提物抑菌活性物質(zhì)對(duì)紫外光具有較高的穩(wěn)定性(圖1).

3 討論

本研究表明，鬼針草醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等有較好的抑制作用，對(duì)荔枝疫霉、水稻紋枯等真菌有較高的抑菌率，對(duì)大腸桿菌無(wú)抑制效果.這與文獻(xiàn)報(bào)道鬼針草的乙醇浸液在體外對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌有良好的抑菌作用[13]，對(duì)金黃色葡萄球菌和真菌有抑制作用[14]相一致.黃酮化合物是鬼針草中的主要有效成分[15－17].眾多研究表明，植物源提取的黃酮類物質(zhì)具有廣譜抑菌性[18－21].鬼針草乙醇提取物較強(qiáng)的抑菌能力，可能與黃酮類物質(zhì)有關(guān)，下一步可對(duì)鬼針草提取物進(jìn)行分離純化，深入探討其活性物質(zhì)的抑菌機(jī)理及其構(gòu)效關(guān)系.

鬼針草藥材資源豐富，且營(yíng)養(yǎng)豐富，含17種氨基酸，其中8種為人體必需的氨基酸，總氨基酸含量達(dá)139.89 g·kg－1，并含有 Ca、Mg、P、Fe 等多種人體必需微量元素[22－24].急性毒理試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，鬼針草屬無(wú)毒類型[25].本試驗(yàn)結(jié)果表明，鬼針草抑菌物質(zhì)提取工藝簡(jiǎn)單，抑菌效果良好，穩(wěn)定性高.因此，以鬼針草為原料，開發(fā)生產(chǎn)新型植物源防腐劑具有一定的潛力.

[1]趙燕，趙瑩，王緒成.鬼針草的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房，2007，18(15):1189－1190.

[2]海珠，宋金斌，朱育鳳.鬼針草的現(xiàn)代研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，1998，9(2):179.

[3]李國(guó)利.三種中藥對(duì)分枝桿菌作用的研究[J].微生物學(xué)通報(bào)，1989，16(3):153－156.

[4]陳建中，葛水蓮，肖玉菲，等.菊科植物鬼針草浸提物抑菌活性研究[J].北方園藝，2012(21):83－85.

[5]周幫靖.常用中藥的抗菌作用及其測(cè)定方法[M].重慶:科技文獻(xiàn)出版社重慶分社，1987:289－306.

[6]曾紹校，林志欽，陳玲，等.蓮子心總黃酮的大孔吸附樹脂純化及其抑菌活性[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2013，42(6):660 －664.

[7]葉舟.烏桕葉提取物抑菌活性研究[J].福建林學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，27(3):231－235.

[8]李凌緒，翟梅枝，林奇英，等.海藻乙醇提取物抗真菌活性[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2006，35(4):342－345.

[9]劉振宇，謝荔巖，吳祖建，等.海藻蛋白質(zhì)提取物對(duì)香蕉炭疽菌的抑制作用[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2006，35(1):21－23.

[10]葉舟.4種林木精油的抑菌活性[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2007，36(3):312－315.

[11]劉國(guó)坤，陳啟建，吳祖建，等.幾種植物提取物對(duì)4種植物病原真菌的抑制作用[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2004，33(3):295 －299.

[12]王杰，張名位，劉興華.苦瓜提取物抑菌作用及其穩(wěn)定性研究[J].食品科技，2004(4):71－74.

[13]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1986:1694.

[14]郝小玲.鬼針草的妙用[J].河南中醫(yī)，2007，27(1):70 －71.

[15]李帥，匡海學(xué)，岡田嘉仁，等.鬼針草化學(xué)成分的研究(Ⅰ)[J].中草藥，2003，34(9):782 －784.

[16]李帥，匡海學(xué)，岡田嘉仁，等.鬼針草有效成分的研究(Ⅱ)[J].中草藥，2004，35(9):972 －975.

[17]黃敏珠，陳海生，劉建國(guó)，等.中藥鬼針草化學(xué)成分的研究[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，27(8):888－891.

[18]王瑋，王琳.黃酮類化合物的研究進(jìn)展[J].沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，4(2):115－119.

[19]陳乃東，周守標(biāo)，羅琦，等.不同提取劑對(duì)春花胡枝子黃酮含量及其抑菌活性影響的研究[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007，17(2):193 －196.

[20]朱丹，牛廣財(cái)，孫希云，等.馬齒莧黃酮類物質(zhì)抑菌作用的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，24(1):7－8.

[21]李葉，唐浩國(guó)，劉建學(xué)，等.黃酮類化合物抑菌作用的研究進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2008(12):53－55.

[22]張延昌，張永明.鬼針草的研究現(xiàn)狀與應(yīng)用前景[J].山東教育學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，19(4):79－83.

[23]李方.野生植物鬼針草營(yíng)養(yǎng)成分的研究[J].山東化工，2007，36(3):37－38.

[24]王建平，秦紅巖，李克華，等.鬼針草中氨基酸和無(wú)機(jī)元素的分析[J].時(shí)珍國(guó)藥研究，1998，9(2):121.

[25]李樹英.鬼針草抗胃潰瘍作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中草藥，1981，12(11):32.