HMBi對肉牛肉品質(zhì)、血清生化指標(biāo)和肌肉組織H-FABP基因mRNA表達(dá)水平的影響

唐 波，王 群，奚雨萌，林麗娟，穆 甜，王建球，韓兆玉

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，江蘇南京210095;2.連云港亨得利畜牧養(yǎng)殖有限公司，江蘇連云港222300)

隨著人民生活水平的提高，消費者對牛肉品質(zhì)的要求越來越高.影響牛肉品質(zhì)的關(guān)鍵因素是肌內(nèi)脂肪含量，表現(xiàn)為大理石花紋的含量及分布.肌內(nèi)脂肪含量影響著肉質(zhì)的嫩度、風(fēng)味和多汁性;在世界各國，肌內(nèi)脂肪含量也是劃分牛肉等級的重要指標(biāo).在分子生物學(xué)飛速發(fā)展的今天，越來越多的研究表明，心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(heart fat acid binding protein，H-FABP)基因?qū)?nèi)脂肪含量的影響顯著[1－2]，在調(diào)控肌內(nèi)脂肪沉積方面發(fā)揮著重要作用.

蛋氨酸是肉牛生長的第一限制性氨基酸[3].研究表明，添加瘤胃保護性蛋氨酸或蛋氨酸羥基類似物(HMB)可以促進(jìn)肉牛生長，增加肉牛氮沉積[4－6].2-羥基-4-甲硫基-丁酸異丙醇酯[2-hydroxy-4-(methylthio)butanoic acid isopropyl ester，HMBi]是一種蛋氨酸添加劑，在反芻動物體內(nèi)先被瘤胃壁吸收，之后分解為蛋氨酸羥基類似物，然后經(jīng)轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)生成蛋氨酸[7].目前，HMBi在反芻動物上的研究主要集中于奶牛上[8－9]，在肉牛上的應(yīng)用則尚未見報道.有研究表明，HMBi能夠提高奶牛的乳脂率[10－11]，由此提示HMBi可能與機體脂肪的沉積和利用有關(guān)，但其具體的作用機理目前尚不清楚，因此有必要進(jìn)行進(jìn)一步研究.本試驗在肉牛的日糧精料中添加HMBi，研究其對肉牛胴體品質(zhì)、血液生化指標(biāo)、肌內(nèi)脂肪含量以及H-FABP基因mRNA表達(dá)量的影響，探討HMBi對肉牛脂肪沉積的作用效果和作用機理，旨在為HMBi在肉牛生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 肉牛分組

選取16頭平均年齡4－5歲、體重相近的徐州黃牛進(jìn)行配對，隨機分為試驗組和對照組，每組8頭.供試牛由江蘇連云港亨得利肉牛場提供.

1.2 肉牛飼養(yǎng)管理

供試16頭牛全部舍飼散養(yǎng)，飼喂精料和粗飼料.基礎(chǔ)精料配方及營養(yǎng)水平見表1.試驗組分別在每頭肉牛的精料中添加8 g·d－1HMBi，對照組的精料不添加HMBi;試驗組和對照組牛飼喂的粗飼料相同.試驗開始的前1周為預(yù)飼期，預(yù)飼期結(jié)束后開始試驗，周期2個月.試驗期每天于上午8:00和下午16:00飼喂日糧，牛自由采食和飲水.供試HMBi的商品名為美斯特(Metasmart)，含HMBi≥57%，由安迪蘇生命科學(xué)制品(上海)有限公司提供.

表1 基礎(chǔ)精料配方及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Ingredient and expected nutrient composition of basis diets(air-dry basis)

1.3 肉牛屠宰與采樣

試驗結(jié)束后，肉牛運送至安徽瀚森荷金來肉牛集團有限公司，禁食、充分休息后統(tǒng)一屠宰.每頭牛經(jīng)宰殺、放血，去頭、蹄、內(nèi)臟，剝皮，劈半，沖洗后測定各項指標(biāo).

屠宰后現(xiàn)場采集肉牛右半胴體的臀中肌和背最長肌(8－12胸椎)，取200 g左右于－20℃冷凍保存，用于測定肌內(nèi)脂肪(即粗脂肪)含量;另取一部分樣品放在凍存管中，于－80℃液氮中保存用于測定總RNA含量.

1.4 肉牛胴體品質(zhì)的測定

屠宰后的胴體在標(biāo)準(zhǔn)排酸車間吊掛排酸4 d后統(tǒng)一進(jìn)行分割.排酸結(jié)束后，測定右半胴體12肋骨處背最長肌的肌肉色、脂肪色和大理石花紋等級等指標(biāo);同時，采集右半胴體12肋骨處背最長肌和臀中肌各500 g，用于測定剪切力和蒸煮損失.

1.4.1 肌肉色和脂肪色 采用便攜式色差儀測定.屠宰后的胴體經(jīng)吊掛冷卻排酸后分割取樣，每個樣品切取一新鮮面，放置30 min后用便攜式色差儀測定色澤，設(shè)置3個平行，取平均值.

1.4.2 大理石花紋等級 參照美國牛肉分級標(biāo)準(zhǔn)，以標(biāo)準(zhǔn)板為依據(jù)，分為豐富、適量、適中、少、較少、微量和幾乎沒有7個級別，分別記為7－1分.

1.4.3 剪切力 將肉塊切成2 cm左右的厚度，放入80℃水浴中加熱30 min后取出，在空氣中冷卻至室溫.用直徑為1.27 cm的圓柱形取樣器避開結(jié)締組織，順著肌纖維方向取下肉樣5個，采用C-LM3B型數(shù)顯式肌肉嫩度儀(品牌:TENOVL)測定剪切力，每個樣品重復(fù)2次.

1.4.4 蒸煮損失 將肉樣切成3 cm×3 cm×1.5 cm左右大小的肉塊，制樣時應(yīng)避開結(jié)締組織，稱重后裝袋.將肉塊放入80℃水浴中加熱30 min后取出，在空氣中冷卻至室溫.用吸水紙吸干表面水分后稱重.蒸煮損失/%=(加熱前肉重－加熱后肉重)/加熱前肉重×100.

1.5 肉牛血清生化指標(biāo)的測定

試驗開始前和結(jié)束后，肉牛于晨飼前由頸靜脈抽血約10 mL，放置至析出血清后，于3000 r·min－1離心10 min，收集血清于小離心管，于－20℃冷凍保存.

血清測定指標(biāo)包括葡萄糖、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、總膽固醇、尿素氮的濃度以及脂肪酶活性，均由南京軍區(qū)總醫(yī)院全自動生化分析儀測定.

1.6 肉牛肌內(nèi)脂肪含量的測定

采用索氏抽提法測定.稱取2 g左右肉樣用定量濾紙包好，稱重后放入索氏抽提器中，以乙醚為抽提劑，于75℃水浴條件下抽提12 h后取出濾紙包，烘干后在干燥器中冷卻至常溫，稱重.

肌內(nèi)脂肪含量/%=(抽提前紙包重－抽提后紙包重)/肉樣重×100.

1.7 肉牛肌肉組織H-FABP基因mRNA表達(dá)水平的測定

1.7.1 引物設(shè)計 根據(jù)NCBI登錄號AC_000159的H-FABP設(shè)計引物F:5－'GTG CGG GAA ATG GTT GA －3'，R:5'－AGC CCA CTG GCA GAA GA －3'，產(chǎn)物長度129 bp，退火溫度56 ℃;F:5－'TCC AGC CTT CCT TCC TGG GCA T －3'，R:5'－GGA CAG CAC CGT GTT GGC GTA GA －3'，產(chǎn)物長度116 bp，退火溫度59℃.引物由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司合成.

1.7.2 組織總RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄 用Total RNA KitⅠ試劑盒(Omega公司)提取肌肉組織總RNA.用二乙基焦磷酸酰胺(DEPC)溶解RNA，紫外分光光度計測定總RNA的濃度和純度(D260nm/D280nm=1.8－2.0)，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量.用隨機引物對總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系25 μL，含2 μg 總 RNA、1 μg 隨機引物、200 U MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶、20 U Rnasin 抑制劑、5 μL 5 ×RT Buffer[含250 mmol·L－1Tris-HCl(pH 8.3)、50 mmol·L－1MgCl2、250 mmol·L－1KCl、50 mmol·L－1DTT、2.5 mmol·L－1Spermidine]、0.4 mmol·L－1dNTP.反應(yīng)程序:50℃延伸1 h，而后于70℃變性10 min，迅速在冰上冷卻得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物.反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物儲存在－20℃.

1.7.3 H-FABP基因mRNA表達(dá)水平的測定 H-FABP mRNA表達(dá)水平采用實時熒光定量儀(7300 Real Time PCR 儀器)評估.總反應(yīng)體系 20 μL:10 μL SYBR Premix Ex Taq、10 pmol·L－1上下游引物各 0.4 μL，2 μL cDNA、0.4 μL ROX Reference Dye、6.8 μL ddH2O.反應(yīng)條件如下:95 ℃預(yù)變性 30 s;PCR 循環(huán)，變性95℃ 5 s，延伸60℃ 31 s，共40個循環(huán);然后72℃延伸7 min.反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行融解曲線分析.

1.8 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)由Excel軟件初步處理后用SPSS 18.0軟件進(jìn)行顯著性統(tǒng)計分析，采用獨立性t檢驗，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.

2 結(jié)果與分析

2.1 HMBi對肉牛胴體品質(zhì)的影響

色澤是肉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一.其中，L*值表示亮度，數(shù)值越小表明肉的顏色越暗;a*值是顏色空間中指示綠色色調(diào)向紅色色調(diào)的過渡，其值越小表明色調(diào)范圍越偏向綠色色調(diào);而b*值越小表明含有越多的藍(lán)色成分而偏藍(lán)色色調(diào).由表2可知:試驗組肉牛肌肉色的L*、a*值略低于對照組，而b*值略高于對照組，但差異均不顯著(P＞0.05);脂肪色的結(jié)果與肌肉色相同，均是試驗組的L*、a*值略低于對照組，而b*值略高于對照組(P＞0.05).在大理石花紋等級方面，試驗組肉牛高于對照組(P=0.153).在剪切力和蒸煮損失方面，試驗組肉牛背最長肌的剪切力小于對照組(P＞0.05)，而蒸煮損失則大于對照組(P＞0.05);試驗組臀中肌的剪切力和蒸煮損失則變化不明顯(P＞0.05).可見，添加HMBi有提高肉牛大理石花紋等級的趨勢，對剪切力、肌肉色、脂肪色和蒸煮損失無明顯影響.

表2 HMBi對肉牛胴體品質(zhì)的影響1)Table 2 Effects of HMBi on carcass quality of beef cattle

2.2 HMBi對肉牛血清生化指標(biāo)的影響

由表3可知:試驗組和對照組肉牛的尿素氮濃度在試驗后均比試驗前發(fā)生了極顯著的下降，試驗組尿素氮濃度在試驗前高于對照組(P＞0.05)，但在試驗后低于對照組(P＞0.05)，表明HMBi對日糧氮的利用效率無顯著影響;試驗組的葡萄糖濃度在試驗前和試驗后均高于對照組(P＞0.05);試驗組的總膽固醇濃度在試驗后呈下降趨勢，但差異不顯著(P＞0.05);在甘油三酯濃度方面，在試驗前，試驗組與對照組的差異不顯著(P＞0.05)，但試驗后極顯著低于對照組(P＜0.01)，表明HMBi能顯著降低膽固醇濃度;試驗組的高密度脂蛋白膽固醇濃度在試驗前略低于對照組(P＞0.05)，而試驗后卻略高于對照組(P＞0.05);在低密度脂蛋白膽固醇濃度方面，試驗后較試驗前試驗組和對照組均有下降趨勢，但差異不顯著(P＞0.05);試驗組脂肪酶活性在試驗前略高于對照組(P＞0.05)，在試驗后低于對照組(P＞0.05).可見，HMBi可以降低肉牛血清甘油三酯水平.

表3 HMBi對肉牛血清生化指標(biāo)的影響1)Table 3 Effects of HMBi on serum biochemical indices of cattle

2.3 HMBi對肉牛肌內(nèi)脂肪含量的影響

由表4可知，試驗組肉牛背最長肌和臀中肌的肌內(nèi)脂肪含量均高于對照組，但差異均不顯著(P ＞0.05).

2.4 HMBi對肉牛肌肉組織 H-FABP基因mRNA表達(dá)水平的影響

由表5可知，試驗組肉牛背最長肌和臀中肌肌肉組織H-FABP基因mRNA的表達(dá)量均高于對照組，但差異均不顯著(P ＞0.05).可見，HMBi對肉牛肌肉組織H-FABP基因mRNA的表達(dá)水平無顯著影響.

表4 肉牛肌肉不同部位的肌內(nèi)脂肪含量1)Table 4 Intramuscular fat content changes in muscles of different parts of beef cattle %

表5 肉牛肌肉組織H-FABP基因mRNA的表達(dá)量1)Table 5 Changes of muscle H-FABP mRNA expression in beef cattle

3 討論

3.1 HMBi對肉牛胴體品質(zhì)的影響

肉色是肉質(zhì)外觀評定的重要指標(biāo)，也是消費者對肉質(zhì)進(jìn)行評價的主要依據(jù)，直接影響消費者的購買欲[12].肉色主要取決于肌肉中的色素物質(zhì)，如果放血充分，則肌紅蛋白的含量及其化學(xué)狀態(tài)是肉色的主要決定因素[13].牛脂肪的顏色主要與其年齡、性別、品種和飼養(yǎng)條件有關(guān)[14].研究表明，飼料中的營養(yǎng)配方能顯著影響肉牛脂肪的顏色[15].本試驗中，試驗組肉牛背最長肌、臀中肌的肌肉色和脂肪色均與對照組的差異不明顯，表明在日糧中添加HMBi對牛肉肌肉色和脂肪色的影響不明顯，不會對消費者的購買欲產(chǎn)生負(fù)面影響.肌內(nèi)脂肪含量是影響牛肉品質(zhì)的關(guān)鍵因素，當(dāng)肌內(nèi)脂肪沉積到一定數(shù)量時即形成大理石花紋[16].本試驗中，與對照組相比，試驗組肉牛背最長肌的大理石花紋等級有提高的趨勢，但沒有達(dá)到顯著水平.剪切力是反映肉質(zhì)嫩度的重要指標(biāo)，研究表明，隨著大理石花紋等級的提高，牛肉嫩度顯著上升[17－18].本試驗中，試驗組肉牛背最長肌的剪切力低于對照組，與文獻(xiàn)[17－18]的研究結(jié)果基本一致.在蒸煮損失方面，試驗組與對照組的差異不明顯，表明日糧中添加HMBi對肉牛牛肉蒸煮損失無影響.

3.2 HMBi對肉牛血清生化指標(biāo)的影響

尿素氮濃度的高低可以作為動物體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝和日糧氨基酸平衡狀況較為準(zhǔn)確的反映指標(biāo)，其濃度與其體內(nèi)氮沉積呈密切相關(guān)性[19].本試驗中，在日糧中添加HMBi對肉牛血清尿素氮濃度的影響不明顯.McCollum et al[6]在綿羊日糧中添加液體蛋氨酸羥基類似物，發(fā)現(xiàn)綿羊?qū)Φ奈漳芰υ鰪?Oke et al[20]在綿羊日糧中添加過瘤胃蛋氨酸，隨著添加水平的提高，綿羊機體的氮沉積水平提高，此結(jié)果與本試驗的結(jié)果有所不同，可能是添加量的差異所致.本試驗中，試驗組肉牛血清葡萄糖濃度在試驗前后均略高于對照組，但差異不顯著，表明在日糧中添加HMBi對肉牛機體的糖代謝影響不明顯，這與郗偉斌等[21]的“在干奶期奶牛日糧中添加HMBi對奶牛的血糖濃度影響較小”的試驗結(jié)果相一致.本試驗中，試驗組肉牛總膽固醇濃度在試驗后略有降低，但甘油三酯濃度在試驗后卻顯著低于對照組.甘油三酯是脂肪代謝的產(chǎn)物，是反映脂肪消化吸收狀態(tài)的直接指標(biāo)，其值越高，表明機體脂肪的利用率低[22].本試驗結(jié)果表明，在日糧中添加HMBi有利于肉牛機體脂肪的沉積作用.肌內(nèi)脂肪與大理石花紋的形成密切相關(guān)，當(dāng)肌內(nèi)脂肪沉積達(dá)到一定比例且分布均勻時才能形成大理石花紋，這也正好解釋了試驗組肉牛背最長肌大理石花紋的等級高于對照組的原因.本試驗中，高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇濃度和脂肪酶活性在試驗前后均無明顯變化，表明在日糧中添加HMBi對其影響不明顯，其原因有待進(jìn)一步研究.

3.3 HMBi對肉牛肌內(nèi)脂肪含量的影響

本試驗中，試驗組肉牛背最長肌和臀中肌的肌內(nèi)脂肪含量高于對照組，表明在日糧中添加HMBi對肉牛機體肌內(nèi)脂肪的形成有促進(jìn)作用.一般認(rèn)為，機體皮下脂肪的形成速率高于肌內(nèi)脂肪[23].從本試驗結(jié)果可以看出，HMBi降低了試驗組肉牛血清甘油三酯的濃度，促進(jìn)了肉牛機體的脂肪沉積，在此基礎(chǔ)上，為肉牛肌內(nèi)脂肪的形成提供了條件，進(jìn)而促進(jìn)了大理石花紋的形成.有關(guān)HMBi影響肉牛肌內(nèi)脂肪形成的研究報道較少，對其在肉牛上促進(jìn)脂肪沉積的作用仍有待更多的試驗數(shù)據(jù)證明.

3.4 HMBi對肉牛肌肉組織H-FABP基因mRNA表達(dá)水平的影響

FABP基因家族參與細(xì)胞中脂肪酸的攝取，協(xié)助將脂肪酸轉(zhuǎn)運到進(jìn)行β-氧化的場所以及甘油三脂和磷脂合成的部位[24]，對機體脂質(zhì)代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用.H-FABP基因廣泛分布于機體各組織中，在肌肉組織中的濃度與組織中脂肪酸的代謝強度密切相關(guān)[25].國內(nèi)外較多的研究表明，H-FABP基因與肌內(nèi)脂肪含量有顯著關(guān)系[26－27].Gerbens et al[2]研究表明，H-FABP基因mRNA的表達(dá)水平與肌內(nèi)脂肪含量呈明顯的相關(guān)性.郝稱莉等[28]研究表明，H-FABP基因的表達(dá)量與湖羊肌肉組織肌內(nèi)脂肪含量呈正相關(guān).本試驗中，試驗組肉牛背最長肌和臀中肌肌肉組織H-FABP基因mRNA的表達(dá)量與對照組間無顯著差異，表明在日糧中添加HMBi對肉牛肌肉組織H-FABP基因mRNA的表達(dá)水平無明顯作用，這與文獻(xiàn)[2，28]的研究結(jié)果不一致.目前對肉牛肌肉組織H-FABP基因的研究報道較少，需要更多的試驗數(shù)據(jù)來支持和表明其對肌內(nèi)脂肪的作用.

4 結(jié)論

在日糧中添加8 g·d－1HMBi有提高肉牛大理石花紋等級的趨勢，對肌肉色、脂肪色、剪切力和蒸煮損失無明顯影響;可以極顯著降低血清甘油三酯濃度;對背最長肌和臀中肌肌肉組織中的脂肪含量和H-FABP基因mRNA的表達(dá)量無顯著影響.

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