金花茶多酚氧化酶基因的克隆及其體胚發(fā)生過程中的表達(dá)分析

高宇瓊，林玉玲，賴鐘雄

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福建福州350002;2.銅仁學(xué)院生物科學(xué)與化學(xué)系，貴州銅仁554300)

金花茶(Camellia nitidissima Chi.)屬于山茶科山茶屬，為灌木狀多年生木本植物，以蠟質(zhì)的黃色花朵而聞名，屬于我國原產(chǎn)的特有種類，是稀有的園林觀花植物[1].除觀賞價(jià)值外，金花茶在人們生活中，尤其是食品、藥用、保健品等工業(yè)中有著重要的作用，但其自然繁殖率低，采用組織培養(yǎng)技術(shù)可以加速其繁殖速度，且有利于種質(zhì)保存以及其他方面研究.有關(guān)金花茶體胚發(fā)生的報(bào)道較多[2－10].研究表明，多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)參與苯丙烷類衍生物代謝、類黃酮及生物堿的合成等生理生化過程，與植物生長發(fā)育、抗逆性等有關(guān)[11－13].有關(guān)山茶屬的PPO基因克隆已有研究[14－15]，但金花茶的PPO基因克隆尚未見報(bào)道.因此，本試驗(yàn)以金花茶成年材料離體再生體系為材料來源，獲得同步化體胚材料，克隆金花茶體胚PPO基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)金花茶體胚發(fā)生過程中PPO基因表達(dá)的變化情況進(jìn)行研究，并測定金花茶體胚發(fā)生過程中PPO活性的變化，以明確金花茶體胚發(fā)生過程中PPO作用的分子機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 供試材料

金花茶胚性培養(yǎng)物由林莉[4]獲得，各階段同步化體胚(球形胚、子葉胚、心形胚、成熟胚及花狀多子葉胚)的獲得參見文獻(xiàn)[8，12].

1.2 儀器與試劑

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)Avanti30為Beckman公司產(chǎn)品，梯度PCR儀Tgradient為Biometra公司產(chǎn)品，水平電泳槽DYCP-31BM、DYCP-31D以及電泳儀DYY-6C為北京市六一儀器廠產(chǎn)品.qPCR儀器用羅氏LightCycler 1.5;試劑:Trizol試劑(Invit rogen)，TaKaRa SYBR ExScript TM RT-PCR Kit(TaKaRa).

Ex Taq酶、pMD18-T載體、膠回收試劑盒、Mark DL2000等購自大連寶生物有限公司(TaKaRa);瓊脂糖、氨芐青霉素、胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂等購自廈門泰京生物技術(shù)有限公司;dNTP購自Promega公司;其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純和超純?cè)噭?

用于RNA操作的用具均用1%DEPC處理后高壓滅菌;其余用于DNA操作的用具也進(jìn)行高壓滅菌處理.核苷酸引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成.

1.3 方法

1.3.1 PPO基因克隆 (1)引物設(shè)計(jì).根據(jù)GenBank上公布的山茶屬植物PPO序列中的保守序列區(qū)，設(shè)計(jì)用于克隆金花茶體胚PPO基因的PCR引物，并進(jìn)行nest_PCR.引物:PPO orf F:5'-ATGGCTTCCA TTCTCCCTCC AACCACCA-3';PPO orf R:5'-TTAAGAATCA AACTCAATCT TGACACCAC-3'.

(2)RNA提取與反轉(zhuǎn)錄反應(yīng).以Trizol法提取的金花茶體胚組織的總RNA為模板，cDNA第一鏈的合成按照RevertAidTMfirst-strand cDNA synthesis kit說明書進(jìn)行操作.

(3)PCR擴(kuò)增.采用PCR擴(kuò)增PPO全長，然后對(duì)第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化.

PCR 反應(yīng)體系為 50 μL，其中模板、10 μmol·L－1上游引物、10 μmol·L－1下游引物各為 2 μL，10 ×Taq PCR buffer為 5 μL，2.5 mmol·L－1dNTP 為 4 μL，Taq Ex(5 U·μL)為 0.4 μL，滅菌水為 34.6 μL.

PCR反應(yīng)程序:94℃變性1 min，54.4℃退火50 s，72℃延伸70 s，循環(huán)數(shù)為35個(gè).循環(huán)前94℃預(yù)變性2 min，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10 min.

擴(kuò)增結(jié)束后將產(chǎn)物保存于4℃.

(4)PCR產(chǎn)物的回收純化.采用TaKaRa(大連)公司的膠回收純化試劑盒純化目的片段.

(5)序列測定.將鑒定正確的含有目的片段的大腸桿菌菌株遞交上海博尚生物技術(shù)有限公司，對(duì)目的片段進(jìn)行測序.

(6)序列比較.用Blast進(jìn)行序列比較，用DNAMAN進(jìn)行氨基酸翻譯，并構(gòu)建進(jìn)化樹.

1.3.2 金花茶體胚發(fā)生過程中PPO的qPCR分析 (1)總RNA提取和cDNA合成.金花茶體胚發(fā)生過程中不同階段的培養(yǎng)物總RNA提取按照Trizol法.逆轉(zhuǎn)錄采用TaKaRa的SYBR ExScriptTM試劑盒，方法參照其說明書.

(2)引物設(shè)計(jì).以茶樹18S rRNA為內(nèi)參基因，檢測PPO基因在金花茶體胚發(fā)生過程中不同發(fā)育階段培養(yǎng)物轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)表達(dá)量，根據(jù)本試驗(yàn)已克隆的金花茶體胚PPO基因及18S rRNA基因的序列，按照qPCR引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物.

18S rRNA基因擴(kuò)增引物:18S rRNA F:5'-CCTGAGAAAC GGCTACCACA T-3';18S rRNA R:5'-CACCAGACTT GCCCTCCA-3'.目的片段 171 bp.

PPO基因擴(kuò)增引物:PPO F:5'-CTGACGCCGA GTACATAGC-3';PPO R:5'-GACTTGGTGA TA-AGCTCCGT-3'.目的片段 134 bp.

(3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR條件優(yōu)化和實(shí)時(shí)定量分析.PCR反應(yīng)體系參照SYBR Premix Ex TaqTM說明書配制.總計(jì)20 μL，其中，cDNA 為1 μL，SYBR Premix Ex TaqTM(2 ×)為10 μL，10 μmol·L－1正向引物0.4 μL，10 μmol·L－1反向引物 0.4 μL，雙蒸水為 8.2 μL.參照孫云等[16]的方法，以 18S rRNA 基因作為內(nèi)參.

PCR反應(yīng)程序(2步法):18S rRNA基因擴(kuò)增:95℃預(yù)變性10 s，95℃變性5 s，60℃退火20 s，40個(gè)循環(huán).PPO基因擴(kuò)增:95℃預(yù)變性10 s，95℃變性5 s，55℃退火20 s，40個(gè)循環(huán).

在Light Cycler 1.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上對(duì)金花茶體胚發(fā)生過程中不同發(fā)育階段培養(yǎng)物進(jìn)行qPCR檢測，每個(gè)樣品設(shè)3管重復(fù)，將所有設(shè)定保存后運(yùn)行程序.反應(yīng)完成后，得到所有樣品的所有記錄點(diǎn)曲線.在調(diào)整基線和閾值后，得出循環(huán)閾值(Ct).

1.3.3 金花茶體胚發(fā)生過程中PPO活性變化檢測 除5個(gè)階段的體胚材料外，增加離體植株作為材料.測定方法參照文獻(xiàn)[17].

酶液粗提液:稱取金花茶體胚發(fā)育過程中不同階段的樣品各1 g，加入5 mL 50 mmol·L－1pH 7.0 PBS(含10%PVP)，冰浴研磨，于15000×g、4℃離心20 min，取上清備用.

PPO 測定:取 2.6 mL 50 mmol·L－1pH 7.0 PBS、0.3 mL 0.1 mol·L－1M4-甲基鄰苯二酚、0.1 mL 酶液粗提液混合.于37℃保溫10 min，迅速放入冰浴中，立即加入2 mL 20%三氯乙酸，以5000×g離心10 min，收集上清液，于410 nm波長下比色.每種樣品重復(fù)3次.

PPO 活性 =(ΔA410VT)/(0.01FW·V1·T)

以每分鐘ΔA410變化0.01為1個(gè)PPO活性單位/(U·g－1·min－1).VT表示提取液總體積/mL;FW表示樣品質(zhì)量/g;V1表示測定時(shí)用去酶液體積/mL;T表示反應(yīng)時(shí)間/min.

2 結(jié)果與分析

2.1 金花茶體胚的獲得與體胚PPO基因的PCR擴(kuò)增

金花茶體胚發(fā)生各階段同步化體胚材料(球形胚、心形胚、子葉胚、成熟胚及花狀多子葉胚)見圖1.以Trizol法提取的金花茶體胚組織的總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA.PCR擴(kuò)增后，經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測，結(jié)果表明:在1800 bp左右擴(kuò)增出目的條帶，與預(yù)期大小一致(圖2).經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增鑒定后，進(jìn)行序列測定.

圖1 金花茶體胚發(fā)生過程各階段材料Fig.1 Materials in each satge during somatic embryogenesis in C.nitidissima

2.2 金花茶體胚PPO基因與編碼氨基酸序列分析

利用序列分析軟件對(duì)測序結(jié)果比較拼接，得到了金花茶體胚PPO基因的cDNA全長序列，其長度為1788個(gè)堿基，含有完整的開放閱讀框(open reading frame，ORF)，GenBank登錄號(hào)FJ597757，編碼為595個(gè)氨基酸殘基.

用Blast將金花茶體胚PPO基因的核苷酸序列與已經(jīng)登錄于GenBank中植物的PPO基因的核苷酸序列進(jìn)行多重比較，結(jié)果表明:金花茶體胚PPO基因的核苷酸序列與一些山茶屬植物的序列較為相似，相似性達(dá)到74%;金花茶與蒲公英(Taraxacum officinale)、葡萄(Vitis vinifera)、梨(Pyrus pyrifolia)、蘋果(Malus x domestica)、李(Populus balsamifera)、楊(Prunus salicina)等草本、藤本、木本植物的PPO基因在核苷酸水平上的相似性為60% －70%.這表明不同植物之間PPO基因的序列差異不大，在植物的進(jìn)化過程中比較保守.

對(duì)金花茶體胚PPO基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行Blast在線分析，結(jié)果(表1)發(fā)現(xiàn)，與已登錄的山茶屬植物的PPO基因氨基酸序列相比對(duì)，除PPO基因氨基酸序列的保守區(qū)序列外，其他部位的序列相似性相對(duì)較低，且同源性均為72%，略低于核苷酸的同源性，如英紅9號(hào)(Camellia sinensis var.assamica)、杭州龍井(Camellia sinensis)、南昆山毛葉茶(Camellia ptilophylla)等.與其他植物PPO基因氨基酸序列相比對(duì)發(fā)現(xiàn)，氨基酸的相似性也較低，同源性為62% －67%，如與葡萄和蒲公英的相似性為66%，與梨的相似性為64%，與油()(Prunus salicina var.cordata)和蘋果的相似性均為62%等.

圖2 金花茶體胚PPO基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳Fig.2 Agarose gel for PCR of PPO gene in C.nitidissima somatic embryos

表1 金花茶體胚PPO基因氨基酸序列Blast比對(duì)結(jié)果Table 1 The results of Blast of PPO amino acid sequence in C.nitidissima somatic embryos

2.3 金花茶PPO基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)分析

利用DNAMAN軟件，將金花茶體胚PPO基因編碼區(qū)序列翻譯成氨基酸序列，分析氨基酸的組成及出現(xiàn)頻率，結(jié)果見表2.從氨基酸的組成看，20種氨基酸都有出現(xiàn)，以丙氨酸出現(xiàn)次數(shù)最多(52次)，其次為亮氨酸(47次)，色氨酸和半胱氨酸出現(xiàn)次數(shù)最少(僅8次).從氨基酸的類型看，非極性氨基酸有8種，共出現(xiàn)259次，占總數(shù)(595次)的43.52%;不帶電荷的極性氨基酸有7種，出現(xiàn)178次，占總數(shù)的29.92%;堿性氨基酸有3種，出現(xiàn)86次，占總數(shù)的14.45%;酸性氨基酸出現(xiàn)72次，占總數(shù)的12.10%.可見，極性氨基酸總數(shù)(336次)超過非極性氨基酸(259次)，說明金花茶體胚PPO為親水性多肽.

利用DNAMAN軟件預(yù)測其二級(jí)結(jié)構(gòu)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)，結(jié)果表明，金花茶體胚PPO分子質(zhì)量約為65.88 kD，等電點(diǎn) pI為6.67;由46.15%的螺旋結(jié)構(gòu)、35.90%的線狀結(jié)構(gòu)和17.95%的折疊結(jié)構(gòu)組成，以螺旋—線狀或螺旋—折疊—線狀交替的結(jié)構(gòu)較多.縱觀蛋白的整體結(jié)構(gòu)，螺旋和線狀結(jié)構(gòu)是金花茶PPO蛋白中含量較多的結(jié)構(gòu)元件，散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中.

表2 金花茶體胚PPO基因編碼的氨基酸組成及出現(xiàn)頻率Table 2 Composition and emerging frequency of amino acids encoded by PPO gene in C.nitidissima somatic embryos

利用DNAMAN軟件對(duì)金花茶體胚PPO親水性的分析表明，金花茶體胚PPO以疏水區(qū)域和親水區(qū)域交替排列.以疏水性氨基酸開頭，卻以親水性氨基酸結(jié)尾，且其中極性氨基酸較多.因此，金花茶體胚PPO為親水性蛋白質(zhì).

2.4 金花茶體胚PPO基因的進(jìn)化樹分析

由圖3可以看出，金花茶體胚PPO基因與國際數(shù)據(jù)庫公布的茶樹PPO基因聚為一類.山茶屬植物不同品種相比，其他種類的茶品種親緣關(guān)系較近，與金花茶親緣關(guān)系稍遠(yuǎn);與其他屬植物品種相比，相對(duì)于草本植物蒲公英來說，金花茶與梨、蘋果、楊等木本植物親緣關(guān)系較近.

圖3 金花茶與其他物種PPO的進(jìn)化樹分析Fig.3 The phylogenetic tree analysis of C.nitidissima PPO with the other species

2.5 金花茶體胚發(fā)生過程中PPO基因相對(duì)定量表達(dá)分析

以18S rRNA作為內(nèi)參基因，利用2－△△Ct方法計(jì)算金花茶體胚發(fā)生過程中不同發(fā)育階段培養(yǎng)物PPO基因的相對(duì)表達(dá)量.以心形胚作為對(duì)照，并定義為1個(gè)單位，對(duì)其他4個(gè)階段培養(yǎng)物進(jìn)行定量分析.結(jié)果(圖4)表明:金花茶體胚發(fā)生過程中，球形胚階段PPO基因表達(dá)量最大，為對(duì)照的3.2倍;子葉胚階段表達(dá)量大幅下降，下降了55%，僅為對(duì)照的1.44倍;體胚發(fā)生后期，表達(dá)量表現(xiàn)為小幅下降，為對(duì)照的40%;而花狀多子葉胚的表達(dá)量也僅為對(duì)照的45%，與正常子葉胚相比，表達(dá)量下降了68%.總體上，PPO轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量與體胚發(fā)育進(jìn)程趨勢(shì)相反.

2.6 金花茶體胚發(fā)育過程中PPO活性變化分析

由圖5可知，金花茶體胚發(fā)育過程中PPO活性整體呈下降趨勢(shì).球形胚、子葉胚以及心形胚3個(gè)階段的PPO活性變化劇烈，存在顯著差異，其中球形胚PPO活性最高，達(dá)25.5 U·g－1·min－1;與心形胚相比，成熟胚的PPO活性略有升高，為12.5 U·g－1·min－1;隨后離體苗的PPO活性又急劇下降，達(dá)到最低點(diǎn)，僅為5 U·g－1·min－1;而花狀多子葉胚(9.55 U·g－1·min－1)PPO 活性僅為正常子葉胚(18.55 U·g－1·min－1)的1/2.這說明PPO影響體細(xì)胞內(nèi)氧化還原的酶促反應(yīng)，也間接地影響體胚形態(tài).總體上，PPO活性變化與體胚發(fā)育進(jìn)程趨勢(shì)相反.

圖4 金花茶體胚發(fā)生過程中PPO基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expression levels of PPO during somatic embryogenesis in C.nitidissima

圖5 金花茶體胚發(fā)生過程中PPO活性變化Fig.5 Variations of PPO activities during somatic embryogenesis in C.nitidissima

3 討論

3.1 金花茶體胚PPO基因的特異性

植物的PPO基因在進(jìn)化過程中具有高度的保守性[18].本研究從金花茶體胚克隆得到的PPO基因核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列與其他植物相比，相似性相對(duì)較低.這可能與PPO基因的復(fù)雜表達(dá)有關(guān)，植物種類、部位、細(xì)胞類型及生長發(fā)育階段不同，PPO基因表達(dá)的種類及表達(dá)量都不同[19].關(guān)于金花茶體胚PPO基因是否具有多基因家族性及有無內(nèi)含子，還有待進(jìn)一步研究.

核苷酸和氨基酸序列相似性值相近，說明不同物種之間部分核苷酸堿基的改變，不會(huì)引起編碼氨基酸很大的變化，與陳忠正等[15]的研究結(jié)果一致.此外，金花茶體胚PPO基因核苷酸和氨基酸序列與已克隆的植物同源性較低，具體原因還需后續(xù)研究.

3.2 金花茶體胚發(fā)生過程中PPO基因相對(duì)表達(dá)量與體胚發(fā)育進(jìn)程的關(guān)系

胚胎發(fā)生的實(shí)現(xiàn)是在內(nèi)源信息作用下，通過轉(zhuǎn)錄與翻譯水平復(fù)雜而精巧的調(diào)控，基因在時(shí)間和空間上選擇性激活和表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞生理代謝的階段性和區(qū)域性差異，從而使形態(tài)建成的物質(zhì)基礎(chǔ)也不同[18].本研究發(fā)現(xiàn)，PPO基因相對(duì)表達(dá)量與體胚發(fā)育進(jìn)程呈反向相關(guān)，說明PPO可能影響金花茶體胚形態(tài)建成，且與PPO mRNA含量在不同階段組織中的變化[12]一致.對(duì)金花茶體胚發(fā)生過程中PPO活性變化的研究表明，金花茶體胚內(nèi)PPO活性在體胚發(fā)生早期含量較高，后期減少;人參體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中PPO活性在早期胚時(shí)也最高[20]，說明PPO與早期胚形成密切相關(guān).PPO活性變化趨勢(shì)與PPO基因熒光定量表達(dá)變化規(guī)律一致.這說明PPO的氧化可能會(huì)影響其細(xì)胞分化[21]，進(jìn)而影響金花茶體胚生長，其真正原因有待進(jìn)一步研究.

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