宮頸上皮內(nèi)瘤變患者淋巴細(xì)胞亞群的分析

呂江濤，孫婷婷，陳飛，譚先杰

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100730）

宮頸 上 皮 內(nèi) 瘤 變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）是由高危型人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）持續(xù)感染引起的一種較常見(jiàn)的宮頸疾病。根據(jù)異常細(xì)胞所占宮頸上皮層范圍的不同，可以將CIN 由輕到重分為CIN1、CIN2、CIN3（包括原位癌）三級(jí)。已經(jīng)清楚，高危型HPV 感染是CIN 和宮頸癌的必要條件，但非充分條件。有資料表明，婦女一生中感染HPV 的機(jī)會(huì)高達(dá)80%，但多數(shù)婦女可在數(shù)月之內(nèi)清除病毒，僅少數(shù)演變?yōu)槌掷m(xù)感染，進(jìn)而發(fā)展成為CIN 甚至宮頸癌［1］。這一現(xiàn)象表明，大多數(shù)婦女具備完善的防御機(jī)制對(duì)抗和清除HPV，僅少數(shù)婦女的防御機(jī)制存在缺陷。研究提示HPV 的清除失敗與機(jī)體的細(xì)胞免疫功能異常有關(guān)［2］，但關(guān)于CIN 患者的全身免疫功能的研究尚少。本研究通過(guò)對(duì)不同級(jí)別的CIN 患者的外周血進(jìn)行T 淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)，以進(jìn)一步了解CIN 患者的全身免疫功能的變化。

資料與方法

一、研究方案

在2013年7月～2013年12月，前瞻性招募于我院門(mén)診就診的宮頸病變患者，與患者簽署知情同意書(shū)之后將其入組研究。所有患者均有液基細(xì)胞學(xué)檢查（TCT）以及HPV的雜交捕獲二代技術(shù)（HC2）定量檢測(cè)結(jié)果。納入條件有：（1）TCT 結(jié)果為低度上皮內(nèi)瘤變（LSIL）及以上；（2）TCT 為不明確意義的不典型鱗狀上皮（ASC-US），高危型HPV 的HC2數(shù)值＞1.0。排除條件有：（1）全身的急、慢性感染性疾??；（2）血液系統(tǒng)疾?。唬?）確診為腫瘤患者。所有患者在納入之后，均進(jìn)行陰道鏡檢查及多點(diǎn)活檢。在活檢之前行術(shù)前檢查，額外抽取患者2ml外周血。

二、主要儀器設(shè)備和試劑

主要儀器包括FACS 流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter，美國(guó)）和離心機(jī)（安亭儀器廠）。主要試劑包括IgG1-異硫氰酸熒光素（FITC）、HLA-DRFITC、CD45RA-FITC、CD45RO-PE、CD38-FITC、CD3-PC5、CD4-PC7、CD8-PC7、溶 血 素（Beckman Coulter，美國(guó)）以及PBS溶液（自配）。

三、實(shí)驗(yàn)方法

采集患者2ml外周血，從體檢中心獲得20份健康女性的外周血標(biāo)本。乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，20h 內(nèi)進(jìn)一步處理。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，將抗體進(jìn)行如下組合：IgG1-FITC／CD3-PC5／CD4-PC7；人類(lèi)白 細(xì) 胞 抗 原（HLA）-DR-FITC／CD3-PC5／CD4-PC7；HLA-DR-FITC／CD3-PC5／CD8-PC7；CD38-FITC／CD3-PC5／CD4-PC7；CD38-FITC／CD3-PC5／CD8-PC7 為三色方案。IgG1-FITC／IgG1-PE／CD3-PC5／CD4-PC7；CD45RA-FITC／CD45RO-PE／CD3-PC5／CD4-PC7；CD45RA-FITC／CD45RO-PE／CD3-PC5／CD8-PC7為四色方案。取8只試管，向其中加入100μl抗凝全血，分別加入上述8種抗體組合，振蕩均勻后避光孵育15min。FITC、PE 標(biāo)記的抗體加入量為10μl，PC5、PC7標(biāo)記的抗體加入量為5μl。每管中分別加入500μl的溶血素，充分振蕩均勻以保證紅細(xì)胞完全碎裂，避光放置10min。每管中加入500μl的PBS緩沖液，混合均勻后離心（1 500r／min，5min）。棄上清液后，再向每管加入500μl的PBS緩沖液，混合均勻后進(jìn)行流式細(xì)胞儀的檢測(cè)。流式細(xì)胞儀獲得數(shù)據(jù)之后，利用軟件CELL QUEST 進(jìn)行熒光參數(shù)分析。調(diào)整電壓及根據(jù)同型對(duì)照進(jìn)行顏色補(bǔ)償，以淋巴細(xì)胞設(shè)門(mén)，讀取免疫表型為CD3＋、CD3＋CD8＋、CD3＋CD4＋、CD3＋CD4＋CD38＋、CD3＋CD4＋HLA-DR＋、CD3＋CD8＋CD38＋、CD3＋CD8＋HLADR＋、CD3＋CD4＋CD45RO＋CD45RA-、CD3＋CD4＋CD45RO-CD45RA＋、CD3＋CD8＋CD45RO-CD45RA＋、CD3＋CD8＋CD45RO-CD45RA＋亞群的百分比。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各淋巴細(xì)胞亞群的百分率均用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，方差分析用于多組間均數(shù)比較，Dunnett法用于各患者組與健康對(duì)照組的兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、基本情況

本研究共收集38 例CIN 患者的外周血，其中CIN1 12例、CIN2 15例、CIN3 11例。與20例對(duì)照組相比，各組患者在年齡、孕產(chǎn)次、HC2值方面沒(méi)有顯著性差異。圖1以CD3＋CD4＋CD38＋T 細(xì)胞的分析過(guò)程為例，說(shuō)明三色方案分析淋巴細(xì)胞亞群的過(guò)程。A圖中縱坐標(biāo)為前向散射光（forward scatter light，F(xiàn)S），與標(biāo)本中細(xì)胞的大小有關(guān)，橫坐標(biāo)為側(cè)向散射光（side scatter light，SS），與標(biāo)本中血細(xì)胞表面被熒光染料標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)有關(guān)。B圖中被圈出的細(xì)胞為CD3＋T細(xì)胞，占所有白細(xì)胞總數(shù)的40.7%。C 圖中橫坐標(biāo)為CD3的表達(dá)量，縱坐標(biāo)為CD4的表達(dá)量，CD3＋T 細(xì)胞被較好地劃分為CD3＋CD4＋T 細(xì)胞和CD3＋CD4-T 細(xì) 胞。D 圖 中 縱 坐 標(biāo) 為CD38 的 表 達(dá) 量，得 到CD3＋CD4＋CD38＋T 細(xì)胞占CD3＋CD4＋T 細(xì)胞的比例為26.6%。同理，圖2以CD3＋CD4＋CD45RO＋T細(xì)胞和CD3＋CD4＋CD45RA＋T 細(xì)胞的分析過(guò)程為例，說(shuō)明四色方案分析淋巴細(xì)胞亞群的過(guò)程。

圖1 三色方案分析淋巴細(xì)胞亞群

圖2 四色方案分析淋巴細(xì)胞亞群

二、CD4＋T細(xì)胞和CD8＋T細(xì)胞的分析結(jié)果

與健康對(duì)照相比，CIN 患者的CD4＋T 細(xì)胞比例有逐漸下降的趨勢(shì)，而CD8＋T 細(xì)胞比例有逐漸增加的趨勢(shì)，但是各組間的差異均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CD4＋T細(xì)胞／CD8＋T細(xì)胞的比值隨宮頸病變級(jí)別增加下降的趨勢(shì)。CIN2 患者（1.05±0.52）與對(duì)照組（1.46±0.43）相比及CIN3患者（0.99±0.58）與對(duì)照組相比，CD4＋T 細(xì)胞／CD8＋T 細(xì)胞的比值均有顯著性差異（表1）。

三、CIN患者T淋巴細(xì)胞亞群的細(xì)分結(jié)果

進(jìn)一步利用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)CD4＋T 細(xì)胞和CD8＋T 細(xì)胞的亞群進(jìn)行細(xì)分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD8＋T細(xì)胞的激活亞群（CD38、HLA-DR），CD4＋T 細(xì)胞和CD8＋T 細(xì)胞的純真亞群（CD45RA）、記憶亞群（CD45RO）在各組之間沒(méi)有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而CIN3患者的CD4＋T 細(xì)胞中的激活亞群（HLA-DR）的比例與健康對(duì)照組比較有顯著增加（表2）。

表1 CIN 患者CD4＋T 細(xì)胞和CD8＋T 細(xì)胞的分析（±s）

表1 CIN 患者CD4＋T 細(xì)胞和CD8＋T 細(xì)胞的分析（±s）

注：與健康對(duì)照組比較，＊P＜0.05

組 別 例數(shù) CD4＋（%） CD8＋（%） CD4＋／CD8＋健康對(duì)照 20 33.4±7.9 24.5±6.6 1.46±0.43 CIN1級(jí) 12 31.9±8.2 25.6±8.1 1.25±0.47 CIN2級(jí) 15 29.8±8.4 28.1±7.2 1.05±0.52＊CIN3級(jí) 11 28.8±7.9 29.5±8.8 0.99±0.58＊

表2 CIN 患者T 淋巴細(xì)胞亞群的細(xì)分結(jié)果［（±s）%］

表2 CIN 患者T 淋巴細(xì)胞亞群的細(xì)分結(jié)果［（±s）%］

注：與健康對(duì)照組比較，＊P＜0.05

組 別 例數(shù) CD38＋CD4＋／CD4＋ HLA-DR＋CD4＋／CD4＋ CD38＋CD8＋／CD8＋ HLA-DR＋CD8＋／CD8＋健康對(duì)照20 31.7± 8.6 11.5±5.4 18.2±6.1 52.4±9.2 CIN1級(jí) 12 30.5±10.4 14.2±7.5 21.3±7.5 51.3±8.1 CIN2級(jí) 15 27.6± 7.3 16.3±6.4 16.5±5.3 47.5±8.8 CIN3級(jí) 11 28.1±11.5 17.8±6.1＊ 17.5±5.9 49.4±7.3組 別 例數(shù) CD4＋CD45RO＋CD45RA-／CD4＋CD4＋CD45ROCD45RA＋／CD4＋CD8＋CD45RO＋CD45RA-／CD8＋CD8＋CD45ROCD45RA＋／CD8＋健康對(duì)照20 56.8±14.2 42.2±12.8 32.6± 9.2 65.0±11.3 CIN1級(jí) 12 57.2±10.6 42.5±11.3 33.5±10.8 64.1±10.6 CIN2級(jí) 15 60.3±15.3 40.6±12.6 39.2±10.9 64.7± 9.3 CIN3級(jí)11 57.7±13.9 42.8±17.2 40.2±11.4 60.5±11.3

討 論

T 淋巴細(xì)胞是人體細(xì)胞免疫系統(tǒng)中具有重要功能的細(xì)胞群。在正常機(jī)體中，只有各T 淋巴細(xì)胞亞群相互作用并維持一定的比例，才能確保人體免疫功能的正常作用。人體免疫系統(tǒng)紊亂的發(fā)生與不同淋巴細(xì)胞亞群的功能和數(shù)量發(fā)生異常有密切關(guān)聯(lián)。人體感染了人免疫缺陷病毒（HIV）后，主要病理過(guò)程就是T 淋巴細(xì)胞免疫系統(tǒng)受損，尤其是CD4＋T淋巴細(xì)胞遭到損害，導(dǎo)致各種機(jī)會(huì)性感染和腫瘤［3］。HIV 感染導(dǎo)致免疫功能異常，特別是細(xì)胞免疫功能受損會(huì)大大增加感染HPV 的風(fēng)險(xiǎn)，而且感染后容易進(jìn)展成為CIN 和宮頸癌［4］。

HPV 是一種嗜上皮細(xì)胞病毒，病毒不進(jìn)入血液中復(fù)制，因此HPV 導(dǎo)致的免疫系統(tǒng)變化應(yīng)該與HIV 有很大不同。上皮細(xì)胞感染HPV 之后，并不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞崩解，病毒復(fù)制和裝配都發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)，等待細(xì)胞死亡之后，再釋放出大量的完整病毒顆粒［5］。在這個(gè)過(guò)程當(dāng)中，沒(méi)有炎癥發(fā)生，機(jī)體也就不會(huì)啟動(dòng)針對(duì)HPV 的免疫清除機(jī)制［6］。盡管HPV感染之后，機(jī)體產(chǎn)生的抗體微乎其微，但是以病毒包膜蛋白為主要成分的HPV 預(yù)防性疫苗卻取得了顯著的效果［7］。然而，在已經(jīng)被HPV 感染甚至已經(jīng)出現(xiàn)CIN 病變的患者中，起主要清除病變作用的是機(jī)體的細(xì)胞免疫功能［2］。

CD4＋T 淋巴細(xì)胞／CD8＋T 淋巴細(xì)胞的比值是反映系統(tǒng)細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)之一。本研究通過(guò)特異性熒光抗體標(biāo)記，用流式細(xì)胞儀對(duì)38 例宮頸上皮內(nèi)瘤變患者的外周血進(jìn)行了T 淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照相比CIN 患者的CD4＋T 細(xì)胞和CD8＋T 細(xì)胞的比例均沒(méi)有顯著性變化，但CIN2患者和CIN3患者的CD4＋T 細(xì)胞／CD8＋T 細(xì)胞的比值顯著下降。這表明CIN 患者確實(shí)存在機(jī)體的全身細(xì)胞免疫功能異常，提示CIN 患者存在CD8＋T 細(xì)胞相對(duì)增加而帶來(lái)的細(xì)胞毒免疫的增強(qiáng)和CD4＋T 細(xì)胞相對(duì)下降而帶來(lái)T 輔助細(xì)胞比例異常的現(xiàn)象。導(dǎo)致此現(xiàn)象的原因可能是機(jī)體的免疫應(yīng)答受到了HPV 感染或者異型增生的宮頸鱗狀上皮細(xì)胞的影響，導(dǎo)致外周血中CD4＋T 淋巴細(xì)胞減少，γ-干擾素、白細(xì)胞介素-2等細(xì)胞因子水平下降，自然殺傷細(xì)胞活性降低、數(shù)量減少。

HIV 感染發(fā)病后，人體免疫系統(tǒng)主要表現(xiàn)為CD4＋T 細(xì)胞計(jì)數(shù)減少，特別是純真CD4 細(xì)胞（CD4＋CD45RA＋）數(shù)目下降；功能亞群（CD28＋）表達(dá)降低；CD8 細(xì)胞激活亞群（CD8＋CD38＋、CD8＋HLA-DR＋）增加，并與HIV 的病毒載量呈正相關(guān)［3］。研究發(fā)現(xiàn)，在HPV 持續(xù)感染的年老婦女的外周血中，表達(dá)CD69和HLA-DR 的激活亞群以及CD8＋T 細(xì) 胞 的 分 化 記 憶 亞 群（CD45RO＋CD27-CD8＋）出現(xiàn)顯著性增加［8］。本研究的獨(dú)創(chuàng)之處在于在CIN 患者中進(jìn)行T 淋巴細(xì)胞亞群的細(xì)分研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比CIN3患者的CD4＋T細(xì)胞中的激活亞群比例增加，提示盡管CIN 患者隨著病情加重CD4＋T 細(xì)胞的相對(duì)數(shù)目下降，但是卻存在異常比例的激活亞群。這可能是CIN 病變加重的原因，也可能是高級(jí)別CIN 病變的結(jié)果。在離體實(shí)驗(yàn)中，HPV 持續(xù)感染的人群的外周血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)促有絲分裂原和抗原的刺激反應(yīng)減弱［9］。結(jié)合此項(xiàng)研究的結(jié)果，我們可以推論慢性HPV 感染引起的CIN 病變，盡管僅存在于宮頸局部，但仍可以引起外周血T 細(xì)胞亞群的比例變化。

本研究通過(guò)對(duì)CIN 患者的CD4＋T 細(xì)胞和CD8＋T 淋巴細(xì)胞進(jìn)行了分析，同時(shí)還對(duì)它們的細(xì)胞表面分化標(biāo)記進(jìn)行研究，從而發(fā)現(xiàn)了CIN 患者的系統(tǒng)免疫功能的異常。這為CIN 患者的免疫治療提供了理論基礎(chǔ)。但是由于本研究屬于單個(gè)時(shí)間點(diǎn)的橫斷面研究而且納入的病例數(shù)較少，暫不能判斷CIN 患者的全身免疫功能的異常是疾病引起的結(jié)果還是導(dǎo)致疾病進(jìn)展的原因。未來(lái)的工作將擴(kuò)大樣本量，并在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)連續(xù)觀察CIN 患者的系統(tǒng)免疫功能變化，以更好地理解HPV 感染導(dǎo)致的CIN病變與人體免疫系統(tǒng)的關(guān)系。

［1］ 邢志艷，徐東艷，郝百連，等.955 例婦科就診婦女人乳頭瘤病毒 感 染 篩 查 結(jié) 果 分 析［J］.生 殖 醫(yī) 學(xué) 雜 志，2013，22：951-953.

［2］ Stanley MA.Immune responses to human papilloma viruses［J］.Indian J Med Res，2009，130：266-276.

［3］ Chakrabarti LA，Simon V.Immune mechanisms of HIV control［J］.Curr Opin Immunol，2010，22：488-496.

［4］ van der Burg SH，Palefsky JM.Human immunodeficiency virus and human papilloma virus-why HPV-induced lesions do not spontaneously resolve and why therapeutic vaccination can be successful［J］.J Transl Med，2009，7：108.

［5］ Stanley MA.Epithelial cell responses to infection with human papillomavirus［J］.Clin Microbiol Rev，2012，25：215-222.

［6］ Kanodia S，F(xiàn)ahey LM，Kast WM.Mechanisms used by human papillomaviruses to escape the host immune response［J］.Curr Cancer drug Tar，2007，7：79-89.

［7］ Paavonen J，Jenkins D，Bosch FX，et al.Efficacy of a prophylactic adjuvanted bivalent L1virus-like-particle vaccine against infection with human papillomavirus types 16and 18 in young women：an interim analysis of a phase III doubleblind，randomised controlled trial［J］.Lancet，2007，369：2161-2170.

［8］ Rodriguez AC，Garcia-Pineres AJ，Hildesheim A，et al.Alterations of T-cell surface markers in older women with persistent human papillomavirus infection［J］.Int J Cancer，2011，128：597-607.

［9］ Garcia-Pineres AJ，Hildesheim A，Herrero R，et al.Persistent human papillomavirus infection is associated with a generalized decrease in immune responsiveness in older women［J］.Cancer Res，2006，66：11070-11076.