芎?湯活血有效部位在大鼠體內(nèi)整體吸收規(guī)律的HPLC指紋圖譜研究*

王孝霞，郭小藤，容蓉，楊勇，趙睜睜，2蔣海強，鞏麗麗

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟南 250355；2.壽光市中醫(yī)醫(yī)院，山東濰坊 262700)

芎?湯出自《千金方》［1］，由川芎(Ligusticum chuanxiong Hort.)和當(dāng)歸［Angelica sinensis (Oliv.)Diels.］兩味藥等量配伍而成，具有養(yǎng)血補血，活血化瘀的功效，是養(yǎng)榮活血的經(jīng)典藥對［2］，臨床上常用于婦女痛經(jīng)治療。已知當(dāng)歸的主要成分為阿魏酸，川芎的主要成分為川芎嗪和阿魏酸。單味藥及其構(gòu)成的復(fù)方藥理作用廣泛，如抗腦缺血、抗血小板聚集等作用［3］。由于中藥復(fù)方組方藥物多，單味藥成分復(fù)雜，其作用的多途徑多靶點性，只能對有限的有效成分進行藥效學(xué)研究，無法反映整體中藥體內(nèi)代謝規(guī)律。故本實驗研究復(fù)方芎?湯活血有效部位在大鼠體內(nèi)的整體吸收規(guī)律。指紋圖譜技術(shù)具有整體性、宏觀性、和模糊分析等特點，可以對中藥整體化學(xué)成分進行良好的表征［4］。

測定給藥動物體內(nèi)多成分代謝的HPLC指紋圖譜，能更好地反應(yīng)多成分在動物體內(nèi)的吸收變化規(guī)律。歐氏距離對于化學(xué)指紋圖譜的相似性具有較好的綜合評價能力［5］。筆者在前期研究工作中，篩選了芎?湯的活血有效部位(Blood-activating part of Xiong-qiong decoction，BAP)。該部位能夠保護心肌細胞，起到抗心肌缺血的作用，能增加紅細胞膜的流動性，改善急性缺血能量代謝障礙的狀態(tài)，防止心肌進一步壞死［6–7］。采用HPLC指紋圖譜技術(shù)測定芎?湯活血有效部位給藥前后大鼠血樣，以給藥之后血樣中多成分整體變化反映藥物多成分在血漿中吸收的變化趨勢，初步探索芎?湯有效部位在大鼠體內(nèi)的整體吸收規(guī)律，為芎?湯體內(nèi)藥效學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供實驗依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1200型，附帶DAD檢測器，四元高壓梯度泵，柱溫箱，美國安捷倫公司；

臺式高速離心機：TGL–16G型，上海醫(yī)用分析儀器廠；

電子天平：Mettler AE240型，瑞士梅特勒公司；

醫(yī)用超聲波清洗器：KQ–500E型，江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE–52C型，上海亞榮生化儀器廠；

川 芎(Ligusticum chuanxiong Hort)，當(dāng) 歸[Angellica sinensis (Oliv)Diels.]：批 號20100911，20100821，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)周鳳琴教授鑒定為經(jīng)加工的規(guī)范飲片，濟南市建聯(lián)藥店；

大孔吸附樹脂：D101型，滄州寶恩吸附材料科技有限公司；

乙腈：色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

實驗用水為純凈水；

實驗所用其它試劑均為分析純。

1.2 實驗動物

SD大 鼠，雌雄兼用，體 重280～300 g。山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SYXK(魯)2011–0002。

1.3 芎?湯活血有效部位灌胃溶液的配制

稱取過0.425 mm(40目)篩的當(dāng)歸、川芎粉末各250 g，加12倍量70%乙醇回流提取3次，每次1.5 h，合并提取液，回收乙醇，濃縮至1 000 mL，制得芎?湯醇提液［8］(每毫升溶液相當(dāng)于0.5 g生藥材)。取900 mL芎?湯醇提液，以1∶3的比例(藥材質(zhì)量與樹脂體積比)過D101大孔樹脂柱［9］，分別用10倍量的水，20%，40%，60%，95%的乙醇依次洗脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇，分別濃縮至450 mL，制得芎?湯大孔吸附樹脂20%，40%，60%，95%乙醇洗脫部位樣品溶液(每毫升樣品溶液相當(dāng)于1 g生藥材)。據(jù)課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，芎?湯活血有效部位主要集中在40%乙醇洗脫部位［6–7］，將其編號為EE40部位。將EE40部位濃縮至40 mL，加3 g吐溫–80，混勻后用蒸餾水定容至100 mL，供大鼠口服給藥，按《人和動物體表面積折算等效劑量比值表》計算相當(dāng)于人臨床等效劑量的5倍為大鼠灌胃劑量，給藥量為18.5 mL／kg。

1.4 大鼠含藥血漿及空白血漿的制備

SD大鼠，禁食(不禁水)12 h，按18.5 mL／kg體重的容量灌胃EE40 部位。給藥后10，15，30，45，90，150，240，300，360 min從大鼠眼底靜脈叢分別采血0.5 mL，以肝素抗凝，3 000 r／min離心10 min，分取血漿0.3 mL，加入3倍量甲醇，10 000 r／min離心10 min，取上清液1 mL，25℃氮氣流吹干，殘余物用100 μL甲醇復(fù)溶，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取10 μL進樣分析。在灌胃前先行取空白血0.5 mL，同法處理，作為空白對照。

1.5 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB–C18(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫公司)；流動相：A為乙腈，B為0.085%磷酸水溶液，梯度洗脫條件見表1；流速：1.0 mL／min；檢測波長：292 nm，參比波長360 nm；柱溫：35℃；進樣量：10 μL。

表1 EE40部位含藥血漿HPLC指紋圖譜流動相條件

2 結(jié)果與討論

2.1 穩(wěn)定性及精密度試驗

取給藥后45 min時間點采集的血樣，按照1.4方法處理，按1.5色譜條件進樣測定，每隔2 h進樣一次，10 h內(nèi)連續(xù)進樣5次，同時考察精密度和樣品10 h內(nèi)的穩(wěn)定性。以6號峰為參比峰，各特征峰保留時間和特征峰面積為指標(biāo)進行考察，結(jié)果見表2(特征峰編號見圖2)。

表2 EE40部位含藥血漿指紋圖譜特征峰穩(wěn)定性及精密度試驗結(jié)果

續(xù)表2

由表2可知，各特征峰相對保留時間的相對標(biāo)準偏差為0.18%～0.91%，各特征峰相對峰面積的相對標(biāo)準偏差為0%～2.15%，表明HPLC指紋圖譜測定精密度良好，樣品在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2 大鼠血樣HPLC指紋圖譜的測定

將1.3中灌胃溶液及EE40部位給藥前后不同時間點的大鼠血漿，按1.5色譜條件進行測定。相關(guān)樣品色譜圖見圖1～圖3。

圖1 空白血漿HPLC指紋圖譜

圖2 EE40部位給藥后10 min血漿HPLC指紋圖譜

圖3 EE40部位HPLC指紋圖譜

2.3 HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)

以色譜峰保留時間和光譜特征為定性指標(biāo)，通過與空白血漿HPLC指紋圖譜比較，提取給藥后血漿的HPLC指紋圖譜中峰面積有明顯變化的色譜峰和新增的色譜峰作為特征峰（特征峰編號見圖2），采集特征峰峰面積，結(jié)果見表3。

表3 EE40部位給藥后血漿HPLC特征峰峰面積(n=3)

2.4 HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)分析

2.4.1 類間相似性計算原理

對于n個含m個指標(biāo)的樣本，可以定義為m維空間的點：在m維空間的任意兩點，其相似性可用“距離”度量，定義為“dij”，若將任意樣本看作一類，其類間相似性可用歐式距離DE表示［10］。歐式距離越大，其類間相似性越差。

按式(1)計算給藥前后不同時間點收集的血樣HPLC指紋圖譜的歐氏距離DE，表征各樣本指紋圖譜間的相似性，考察樣本中多成分的總體變化趨勢。

式中：l—樣本指標(biāo)數(shù)，即特征峰個數(shù)l=1，2，3…m；

i，j——樣本序號，即不同時間段采集的樣本；

xil，xjl——樣本各指標(biāo)，即特征峰面積。

2.4.2 歐氏距離的計算

將給藥后樣品作為i樣本、給藥前樣品作為j樣本，以HPLC特征峰面積為指標(biāo)，計算給藥前不同時間點收集的血漿HPLC指紋圖譜特征峰與給藥后不同時間點收集的血漿HPLC指紋圖譜特征峰的歐氏距離DE，結(jié)果見表4。以歐氏距離DE為縱坐標(biāo)、給藥后的取樣時間為橫坐標(biāo)繪圖，結(jié)果見圖4。

表4 EE40部位大鼠含藥血漿與空白血漿的歐氏距離DE

圖4 EE40部位給藥后血樣HPLC指紋圖譜特征峰歐氏距離變化

由圖4可知，EE40部位大鼠給藥后血漿整體成分在45 min時變化達到最高值，1.5 h之內(nèi)變化顯著，隨后變化較小。提示該復(fù)方藥對EE40部位在45 mim吸收達到極值，1.5 h內(nèi)藥物在機體內(nèi)的總體血藥濃度保持在較高水平。該研究解釋了活血有效部位動物體內(nèi)的整體吸收趨勢，為今后臨床合理用藥提供依據(jù)［11］。

3 結(jié)論

中藥復(fù)方具有多成分協(xié)同作用的特點，以HPLC指紋圖譜研究芎?湯提取物大鼠給藥前后血漿成分隨時間的變化信息，可以較全面地反映復(fù)方藥物在體內(nèi)的吸收情況。對于指紋圖譜的數(shù)據(jù)處理，采用歐氏距離計算指紋圖譜中多個特征值的變化，可以全面、客觀地度量圖譜間的差異，從整體上反映給藥前后血樣指紋圖譜的變化。因此利用該方法研究復(fù)方中藥在體內(nèi)的吸收過程，符合中藥整體作用的特點，為闡述中藥復(fù)方的整體作用機制提供方法學(xué)基礎(chǔ)，為進一步研究復(fù)方中藥體內(nèi)的代謝規(guī)律提供依據(jù)。

實驗中以色譜峰保留時間和峰面積為指標(biāo)，通過與空白血漿樣品指紋圖譜比較，發(fā)現(xiàn)給藥后血漿樣品的HPLC指紋圖譜的部分色譜峰與給藥前樣品相同，屬內(nèi)源性成分；新增色譜峰為增加的成分，可能來自芎?湯EE40部位原成分及其代謝產(chǎn)物。這些成分的結(jié)構(gòu)確定有待于進一步研究。

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