長葉點(diǎn)地梅的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)條件

張彥妮，陳素波

(東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040)

報(bào)春花科植物共22屬，約1 000種，其中點(diǎn)地梅屬(Androsace)約有120種，分布于北半球溫帶，其中青藏高原地區(qū)和歐洲的阿爾卑斯山脈是該屬的兩個分布中心。中國有73個種7個變種，主要分布在青藏高原，適應(yīng)高緯度地區(qū)生長，有部分種類分布在西北至內(nèi)蒙古、東北以及秦嶺以南各省區(qū)［1］。

目前，點(diǎn)地梅屬植物的相關(guān)研究主要集中在化學(xué)成分的提取、藥理作用、臨床方面。已經(jīng)從該屬中提取了黃酮類化合物［2-4］和11個三萜皂苷類成分［5-7］;在北點(diǎn)地梅(A.septentrionalis)中發(fā)現(xiàn) 11-cishexadecenoic acid 和 9-cis，12-cishexade-cadienoic acid兩種植物中罕見的脂肪酸［8］。點(diǎn)地梅屬的藥理作用主要體現(xiàn)在能顯著提高人肝癌細(xì)胞的抗增殖活性［9］、抑制人肺癌細(xì)胞A549、肝癌細(xì)胞BEL-7402和胃癌細(xì)胞 SGC7901的增殖等［10］。在臨床方面，主要用于治療咽喉炎和慢性咽喉腫痛［11］。所以點(diǎn)地梅屬植物具有重要的藥用價(jià)值。

懸浮培養(yǎng)作為一種植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，主要是指愈傷組織在液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)過程［12］，主要應(yīng)用于獲得再生植株和細(xì)胞內(nèi)的次生代謝物質(zhì)。長葉點(diǎn)地梅(A.longifolia)又稱矮葶點(diǎn)地梅，為點(diǎn)地梅屬多年生草本，葉叢生，線性，灰綠色，花冠白色，喉部紫紅色，花朵嬌小，花期為5月，是東北地區(qū)難得的早春花卉，更是一種不可多得的富有野趣的草坪植物和優(yōu)良地被植物。目前，僅見通過葉片對長葉點(diǎn)地梅進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生的報(bào)道［13］，要使其快速地應(yīng)用于園林綠化，就需要有大量的苗源。本研究以長葉點(diǎn)地梅愈傷組織作為試驗(yàn)材料，對其不同激素條件下細(xì)胞生長、培養(yǎng)液pH值、電導(dǎo)率的變化、對碳源的消耗等研究，以期為其液體懸浮培養(yǎng)及原生質(zhì)體懸浮培養(yǎng)再生體系的建立提供一定的參考，同時為點(diǎn)地梅屬植物利用懸浮培養(yǎng)進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在培養(yǎng)基 MS+1.0 mg·L－1，2，4-D+0.2 mg·L－16-BA上篩選出的淡綠色、疏松的愈傷組織。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑對懸浮細(xì)胞生長的影響 將1.0 g(依據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果)淡綠色、疏松愈傷組織分別接種于加有不同濃度2，4-D(0.4、0.6、0.8、1.0 mg·L－1)、或 6-BA(0.1、0.2、0.3、0.4 mg·L－1)的盛有 50 mL MS 液體培養(yǎng)基(滅菌前pH為5.4)的100 mL三角瓶中，于搖床上培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速100 r·min－1)，培養(yǎng)溫度25℃，光周期16 h/8 h。比較激素種類或濃度對細(xì)胞干質(zhì)量的影響。每3 d測一次細(xì)胞干質(zhì)量，每組重復(fù)3次，取平均值測至30 d。以培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo)，以細(xì)胞干質(zhì)量為縱坐標(biāo)，繪制長葉點(diǎn)地梅的愈傷懸浮培養(yǎng)的生長曲線。

1.2.2 不同蔗糖濃度下愈傷組織對碳源的消耗規(guī)律將1.0 g淡綠色、疏松愈傷組織接種于蔗糖濃度分別為1%、2%、3%、4%的50 mL MS液體培養(yǎng)基(添加上面試驗(yàn)選出的最佳激素濃度，滅菌前pH為5.4)中，于搖床上培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速100 r·min－1)，培養(yǎng)溫度25℃，24 h光照下培養(yǎng)。利用3，5-二硝基水楊酸法測定還原糖，以蒽酮法測定蔗糖、果糖、葡萄糖［14］。

1.2.3 搖床轉(zhuǎn)速對細(xì)胞生長的影響 將1.0 g淡綠色、疏松愈傷組織接種于加有上面試驗(yàn)篩選出的最佳濃度的激素和蔗糖的50 mL MS液體培養(yǎng)基(滅菌前pH值為5.4)中，于不同轉(zhuǎn)速(設(shè)為75、85、95、105、115、125 r·min－1)的搖床上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃，光照下培養(yǎng)。12 d后(依據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果)測細(xì)胞干質(zhì)量。

1.2.4 培養(yǎng)液pH值、電導(dǎo)率及干質(zhì)量的測定 每100 mL三角瓶盛有50 mL培養(yǎng)液(上面試驗(yàn)篩選出的最佳MS液體培養(yǎng)基，滅菌前pH為5.4)，接種1.0 g淡綠色、疏松愈傷組織，培養(yǎng)溫度25℃，24 h光照下培養(yǎng)。定期測定培養(yǎng)液pH、電導(dǎo)率和細(xì)胞干質(zhì)量。

pH 測定:每隔3 d 取樣一次，1 000 r·min－1離心4 min，用精密pH計(jì)測定上清液酸堿度，每個試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

電導(dǎo)率的測定:每隔3 d取一次懸浮培養(yǎng)的長葉點(diǎn)地梅培養(yǎng)液，過濾所得培養(yǎng)液用電導(dǎo)儀測定電導(dǎo)率，單位為 ms·cm－1。

干質(zhì)量的測定:將三角瓶中的懸浮細(xì)胞用蒸餾水將殘留的細(xì)胞培養(yǎng)液沖洗干凈，再用濾紙將水分吸干，將細(xì)胞于60℃烘箱中烘干72 h后稱其干質(zhì)量。每3 d測一次細(xì)胞干質(zhì)量，每次重復(fù)3組，取平均值測至30 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對懸浮細(xì)胞生長的影響

不同濃度的6-BA對懸浮細(xì)胞的生長均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(圖1)。在前9 d，各個濃度的6-BA對細(xì)胞生長影響差異不大，低濃度(0.1 mg·L－1)6-BA中細(xì)胞干質(zhì)量達(dá)到峰值所需時間較短(9 d)，但數(shù)值小于其他3個濃度下的細(xì)胞干質(zhì)量。當(dāng)6-BA的濃度為0.3 mg·L－1時，細(xì)胞干質(zhì)量值最大(0.153 g)，細(xì)胞的生長最旺盛，下降速度較為緩慢。而在6-BA濃度升至0.4 mg·L－1時，細(xì)胞干質(zhì)量有所下降，而且在達(dá)到最高峰時，細(xì)胞干質(zhì)量急劇下降，可能是由于高濃度的細(xì)胞分裂素加速了細(xì)胞死亡［15］的原因。

不同2，4-D濃度對細(xì)胞生長的影響呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(圖1)。在培養(yǎng)9 d時，2，4-D濃度為0.4 mg·L－1時細(xì)胞干質(zhì)量開始下降，但下降速度較為緩慢。在12 d時，其他3個濃度下的細(xì)胞干質(zhì)量均達(dá)到峰值，但0.6 mg·L－1時 2，4-D 的細(xì)胞干質(zhì)量最大(0.14 g)，1.0 mg·L－1時細(xì)胞干質(zhì)量最低，說明2，4-D濃度過高時，會抑制細(xì)胞增殖。

綜上所述，長葉點(diǎn)地梅懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的最佳激素為0.3 mg·L－16-BA，應(yīng)在12 d之前獲取細(xì)胞材料，以保持良好的細(xì)胞分裂能力。

2.2 不同蔗糖濃度下對碳源的消耗規(guī)律

在MS液體培養(yǎng)基中加入0.3 mg·L－16-BA，培養(yǎng)12 d時獲取新鮮細(xì)胞測量干質(zhì)量。液體培養(yǎng)基中的蔗糖首先被迅速水解為等分子的葡萄糖和果糖，然后被細(xì)胞吸收利用(圖2)。當(dāng)蔗糖濃度為1%時，蔗糖迅速水解，在3－12 d期間葡萄糖和果糖等活性糖的含量不斷減少，培養(yǎng)12 d時，幾乎被完全利用，易使長葉點(diǎn)地梅懸浮細(xì)胞處于碳源饑餓狀態(tài)，不能充分滿足甚至限制細(xì)胞的生長。隨著蔗糖濃度的增加，當(dāng)濃度達(dá)到3%時，在懸浮培養(yǎng)0－3 d，細(xì)胞生長處于遲滯期，蔗糖水解為活性多糖積累較慢，進(jìn)入6－12 d，細(xì)胞生長處于對數(shù)期，活性糖的積累較多，之后下降緩慢，但到30 d時活性糖的量仍很多，說明培養(yǎng)基中的碳源能夠很好地供細(xì)胞生長，當(dāng)蔗糖濃度達(dá)到4%時，活性糖的積累量減少，蔗糖水解速度減慢。

過低和過高的蔗糖濃度都不利于活性多糖的積累，較低或較高的蔗糖濃度，影響培養(yǎng)液的滲透壓，致使細(xì)胞增殖率較低，這可能與長葉點(diǎn)地梅的細(xì)胞內(nèi)還原糖的積累和代謝水平有關(guān)。當(dāng)蔗糖濃度為2%時，細(xì)胞生長狀態(tài)最佳，干質(zhì)量值接近于蔗糖濃度3%的干質(zhì)量值(圖3A)，因此，總體來說，當(dāng)接種量為1 g時，長葉點(diǎn)地梅細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的最佳蔗糖濃度為2%。

2.3 搖床轉(zhuǎn)速對細(xì)胞生長的影響

當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為105 r·min－1時，細(xì)胞干質(zhì)量最大(0.150 g);轉(zhuǎn)速為 125 r·min－1時，細(xì)胞部分死亡，三角瓶中的液體培養(yǎng)基變渾濁，干質(zhì)量有所下降(圖3B)。所以，長葉點(diǎn)地梅愈傷懸浮培養(yǎng)的最佳搖床轉(zhuǎn)速為 105 r·min－1。

圖1 不同6-BA和2，4-D濃度對懸浮細(xì)胞干質(zhì)量的影響Fig.1 Effects of different 6-BA and 2，4-D concentrations on cell dry weight in suspension cultures

圖2 不同起始蔗糖濃度下細(xì)胞外各種糖的變化Fig.2 Concentration changes of different sugar outside the cell in cell suspension cultures at various initial sucrose concentrations

圖3 不同蔗糖濃度(A)和搖床轉(zhuǎn)數(shù)(B)對細(xì)胞干質(zhì)量的影響Fig.3 Effects of sucrose concentrations(A)and shaker rate(B)on the cell dry weight in cell suspension cultures

2.4 培養(yǎng)液pH及電導(dǎo)率、細(xì)胞干質(zhì)量的測定

MS液體培養(yǎng)基中附加2%蔗糖、0.3 mg·L－16-BA，接種1 g愈傷組織，搖床轉(zhuǎn)速為105 r·min－1，定期測定培養(yǎng)液pH及電導(dǎo)率，12 d后測細(xì)胞干質(zhì)量。

在整個生長周期中，長葉點(diǎn)地梅細(xì)胞培養(yǎng)液的pH呈先下降后緩慢上升的變化趨勢(圖4A)，曲線近似“V”字形變化。滅菌前培養(yǎng)基的pH為5.4，可能由于滅菌過程中培養(yǎng)基中的水分散失的原因，滅菌后pH下降到5.32。在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的0－12 d，細(xì)胞生長處于延滯期，pH由起始的5.32降至4.01，在13－21 d時，pH開始回升，之后pH雖呈波動性變化，但總體上基本保持穩(wěn)定，可能細(xì)胞自身的調(diào)節(jié)能力起到一定作用，這種調(diào)節(jié)作用是有限的，超過這個限度就會對細(xì)胞分裂生長起到抑制作用，不利于細(xì)胞生長。一方面pH的“V”形變化可能與植物細(xì)胞對離子的吸收先后有關(guān)，植物細(xì)胞優(yōu)先利用培養(yǎng)液中的NH4+，使pH迅速下降，隨后再利用NO3－，導(dǎo)致pH逐漸回升，另一方面細(xì)胞在從培養(yǎng)液中吸收營養(yǎng)物質(zhì)的同時，還會釋放出一些代謝產(chǎn)物，如生物堿、氨基酸等，這些都會導(dǎo)致培養(yǎng)液pH呈波動性變化。由于pH值的升降影響了細(xì)胞質(zhì)膜的電位、通透性及細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的交換，從而控制了細(xì)胞的生長［16］。

電導(dǎo)率可在一定程度上反映出液體培養(yǎng)基中的離子總量，因此，從溶液電導(dǎo)率的升降程度可以了解營養(yǎng)物質(zhì)消耗的情況及細(xì)胞生長狀態(tài)。在0－15 d，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中隨著細(xì)胞數(shù)量的增加，溶液的電導(dǎo)率呈下降趨勢。在15 d左右，培養(yǎng)液的電導(dǎo)率達(dá)到最低(圖4B)。

圖4 不同時期細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液pH值(A)和電導(dǎo)率(B)變化Fig.4 Variations of p H values(A)and conductivity(B)in cell suspension cultures during different cell growing period

長葉點(diǎn)地梅細(xì)胞懸浮生長的干質(zhì)量曲線近似“S”形，開始的0－3 d，細(xì)胞生長處于遲滯期，分裂速度較慢，加之細(xì)胞對新環(huán)境的適應(yīng)，可能有小部分死亡，細(xì)胞干質(zhì)量下降;4－12 d細(xì)胞處于對數(shù)生長期，生長速度和細(xì)胞數(shù)量大幅度提高;12 d以后，細(xì)胞干質(zhì)量開始呈下降趨勢，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能是蔗糖的消耗和次級代謝物質(zhì)中有害物質(zhì)的積累，不利于細(xì)胞生長，導(dǎo)致細(xì)胞開始死亡，在30 d時，細(xì)胞已經(jīng)大量死亡，干質(zhì)量下降(圖5)。因此，長葉點(diǎn)地梅懸浮細(xì)胞的最佳獲得時間為12 d左右。

圖5 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)不同生長時期細(xì)胞干質(zhì)量的變化Fig.5 Changes of cell dry weight in suspension cultures during cell growing period

3 討論

植物材料在同等條件下的液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)不同。在液體培養(yǎng)基中細(xì)胞能與營養(yǎng)物質(zhì)的接觸面積更充分，但氣體交換能力相對固體培養(yǎng)較弱，因此，對愈傷組織質(zhì)量、接種量、激素濃度、蔗糖濃度、搖床轉(zhuǎn)速等要求不同。本研究表明，低濃度碳源雖有利于加快細(xì)胞增殖的速度，但不能使細(xì)胞達(dá)到最佳狀態(tài)，高濃度的碳源會抑制細(xì)胞的增殖，長葉點(diǎn)地梅愈傷懸浮培養(yǎng)的最佳蔗糖濃度為2%。不同的植物種類懸浮培養(yǎng)所用的激素種類和濃度差異很大，夜香牛(Vernonia cinerea)在基本培養(yǎng)基中加3%的蔗糖、1.0 mg·L－1NAA 和0.1 mg·L－1BA時培養(yǎng)4周后獲得的生物量最高(9.85 g)［17］。本研究比較了 2，4-D 和 6-BA，0.3 mg·L－1的6-BA更有利于細(xì)胞增殖。新鮮愈傷在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)時，細(xì)胞的分散程度與搖床的轉(zhuǎn)速有關(guān)，搖床的轉(zhuǎn)速也會對細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響，轉(zhuǎn)速太慢細(xì)胞不能夠形成均勻的分散系，轉(zhuǎn)速過快搖床產(chǎn)生的剪切力會破壞細(xì)胞，因此，適宜的轉(zhuǎn)速也是影響細(xì)胞生長的因素之一。但不同植物細(xì)胞對搖床轉(zhuǎn)速要求不同，如石榴懸浮培養(yǎng)搖床轉(zhuǎn)速110 r·min－1［18］。搖床的轉(zhuǎn)速影響了細(xì)胞增殖，但相對其他因素，其作用效果很小，一般轉(zhuǎn)速控制在90～120 r·min－1［19］，但有的植物要求轉(zhuǎn)速較低，如野生草珊瑚(Sarcandra globra)的懸浮細(xì)胞在100 r·min－1速度下幾乎不能存活，最佳的搖床轉(zhuǎn)速為40 r·min－1［20］。長葉點(diǎn)地梅細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的最佳搖床轉(zhuǎn)速為 105 r·min－1。

長葉點(diǎn)地梅懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系的研究為進(jìn)一步完善點(diǎn)地梅再生體系建立、次生代謝生產(chǎn)和逆境因子研究等奠定了基礎(chǔ)，同時，為利用生物工程技術(shù)從點(diǎn)地梅屬植物中獲取有效藥用成分、緩解天然資源壓力提供新的研究思路。

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