濟(jì)南小清河水樣細(xì)菌的分離、分子鑒定及對(duì)污染河水的修復(fù)作用

岳壽松+邊斐+鄒曉鳳+王翠萍+孫林波+田順+孫凱+陳文娟

摘 要：從濟(jì)南小清河水樣中共獲得不同菌落特征的細(xì)菌微生物13種，利用分子生物學(xué)方法對(duì)培養(yǎng)得到的菌株進(jìn)行分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明：13株微生物分屬于8個(gè)屬，分別為腸桿菌屬（Enterobacter）、氣單胞菌屬（Aeromonas）、克雷伯氏菌屬 （Klebsiella）、微桿菌屬（Microbacterium）、希瓦氏菌屬（Shewanella）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、枸櫞酸桿菌屬（Citrobacter）和寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）。研究了地衣芽孢桿菌QH11和嗜麥芽寡養(yǎng)（窄食）單胞菌QH13對(duì)水體化學(xué)需氧量（CODCr）和氨氮（NH3-N）的去除作用，結(jié)果表明，處理5天后，QH11對(duì) CODCr和NH3-N的去除率分別為70.6%和84.8%， QH13的去除率分別為58.5%和52.3%。

關(guān)鍵詞：小清河；細(xì)菌；分子鑒定；生物修復(fù)

中圖分類(lèi)號(hào)：S182：X522 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2014）11-0063-05

小清河發(fā)源于濟(jì)南市，全長(zhǎng)237 km，其中濟(jì)南河段位于城區(qū)北部，是省城主城區(qū)唯一的防洪除澇和排污河道[1]。小清河為典型城市內(nèi)河，已成為濟(jì)南市城市生態(tài)系統(tǒng)重要的組成部分。近幾十年來(lái)，隨著城市化進(jìn)程的不斷加快，城市人口聚集，經(jīng)濟(jì)活動(dòng)日趨頻繁，工業(yè)廢水和生活污水大量排放，河水污染逐漸加重，不但制約城市的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)與環(huán)境可持續(xù)發(fā)展，同時(shí)危及人類(lèi)身體健康。

河道水體是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，微生物為生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分。水體中的微生物種群分布與區(qū)域環(huán)境有著密切聯(lián)系，在物質(zhì)循環(huán)與能量流動(dòng)中發(fā)揮著非常重要的作用[2～4]。河水污染產(chǎn)生的有害氣味以及主要污染指標(biāo)總氮（TH）和總磷（TP）含量等均與水體微生物的種群特點(diǎn)密切相關(guān)[5，6]。微生物對(duì)水體凈化具有重要作用，水體污染的微生物修復(fù)技術(shù)越來(lái)越受重視。在污染水體中，微生物經(jīng)過(guò)馴化后大量繁殖，通過(guò)其代謝作用將水體中有害的無(wú)機(jī)物、部分復(fù)雜的有機(jī)物分解為簡(jiǎn)單的、穩(wěn)定的無(wú)毒物質(zhì)，增強(qiáng)水體的自?xún)裟芰7～10]。與其他治污方法相比，微生物修復(fù)技術(shù)沒(méi)有二次污染、效果穩(wěn)定、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，有利于自然生態(tài)的恢復(fù)。根據(jù)不同水體特點(diǎn)篩選功能微生物，對(duì)提高污染修復(fù)的效率和效益具有重要意義。

本研究對(duì)濟(jì)南小清河河水細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，并利用16S rDNA序列分析進(jìn)行鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析，篩選具有降低水體CODCr和氨氮含量的微生物，為濟(jì)南小清河水質(zhì)改善提供理論依據(jù)，同時(shí)為城市河道污染的原位修復(fù)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及細(xì)菌分離純化

水樣采集于濟(jì)南小清河還鄉(xiāng)店位點(diǎn)。取樣時(shí)間2013年6月19日，為雨季到來(lái)前的枯水期，河水水質(zhì)較差。利用LB培養(yǎng)基分別對(duì)水樣原液、10-1、10-2和10-3梯度稀釋液平板涂布法培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時(shí)間48 h。選取典型菌落，記錄其形態(tài)特點(diǎn)，革蘭氏染色觀察菌株形態(tài)。純化菌株進(jìn)行分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析。

1.2 細(xì)菌16S rDNA基因的克隆、測(cè)序

DNA提取、酶切、連接和轉(zhuǎn)化等操作方法參照文獻(xiàn)[11]。擴(kuò)增引物上游P1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游P2：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACT-3′。PCR條件：95℃ 5 min；94℃ 40 s， 55℃ 40 s， 72℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收后克隆至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α，將陽(yáng)性克隆送北京博尚生物公司測(cè)序。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

將16S rDNA序列與GenBank已知核酸序列進(jìn)行BLAST分析。把與該序列同源性較高的已知菌株的16S rDNA基因序列，用ClustalX 1.83進(jìn)行多序列比對(duì)，采用Neighbor-Joining方法，通過(guò)MEGA 5.10軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4 細(xì)菌對(duì)污染河水的修復(fù)作用

1.4.1 試驗(yàn)菌種 地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）和嗜麥芽寡養(yǎng)（窄食）單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）均分離自小清河水樣。液體培養(yǎng)繁殖，調(diào)節(jié)菌液濃度為108 cfu/mL，4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 菌株對(duì)河水CODCr、氨氮的去除作用 4 L反應(yīng)器（直徑15 cm）加入3.7 L小清河水樣。按1‰量（V/V）加入各菌劑，對(duì)照不加菌劑。每天測(cè)定CODCr和氨氮含量。CODCr采用重酪酸鉀法測(cè)定，氨氮采用納氏比色法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 小清河水樣細(xì)菌分離

利用LB培養(yǎng)基對(duì)小清河水樣中的細(xì)菌進(jìn)行分離與培養(yǎng)，從各梯度培養(yǎng)基共選取13種典型菌落，記錄菌落形態(tài)特點(diǎn)，革蘭氏染色觀察菌株形態(tài)（表1）。

2.2 小清河水樣細(xì)菌分子鑒定

利用引物P1/P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得菌株QH01～QH13的16S rDNA。PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析，得到每一菌株的16S rDNA序列全長(zhǎng)，將序列提交至GenBank進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

進(jìn)一步利用生物軟件ClustalX 1.83和MEGA 5.10、采用鄰接法（neighbor-joining method）構(gòu)建16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，以自展分析 （bootstraping） 法評(píng)估發(fā)育樹(shù)，去除置信度低于50%的分支。結(jié)果（圖1）表明，菌株QH02、QH06和QH10親緣關(guān)系較近，為氣單胞菌屬（Aeromonas）。其中QH02與嗜水氣單胞菌A. hydrophila CECT-5745最近緣、QH06與豚鼠氣單胞菌A. caviae P087最近緣、QH10 與A. caviae SCSB1最近緣。QH03與克雷伯氏菌聚在一群，且與Klebsiella sp. HE1最近緣。QH01與腸桿菌屬Enterobacter聚為一族，與霍氏腸桿菌E. hormaechei ASU-001 近緣。QH12 與枸櫞酸桿菌屬（Citrobacter） 聚為一族，與弗氏枸櫞酸桿菌C. freundii MRB070408-1最近緣。QH07與希瓦氏菌屬（Shewanella）聚為一族，與腐敗希瓦氏菌S. putrefaciens Hac334近緣。QH13 與寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas）聚為一族，與嗜麥芽寡養(yǎng)（窄食）單胞菌S. maltophilia YSP48近緣。QH09和QH11與芽孢桿菌屬（Bacillus）聚為一族，QH09與短小芽孢桿菌B. pumilus N0819 最近緣，QH11與地衣芽孢桿菌B. licheniformis KVR最近緣。QH04和QH05與微桿菌屬（Microbacterium）聚為一族，QH04與微桿菌Microbacterium sp. Long-2最近緣，QH05與磚紅色微桿菌M. testaceum IARI-BHI-3最近緣。QHO8與金黃桿菌屬（Chryseobacterium）聚為一族，與C. taeanense ARB-2 最近緣。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果與BLAST比對(duì)結(jié)果一致。endprint

2.4 不同菌株對(duì)污染河水的修復(fù)作用

2.4.1 不同菌株對(duì)河水CODCr的去除作用 研究了地衣芽孢桿菌QH11、短小芽孢桿菌QH09和嗜麥芽寡養(yǎng)（窄食）單胞菌QH13對(duì)水體CODCr含量的影響。加入菌劑2天后水體CODCr下降趨勢(shì)明顯，到第5天時(shí)，與對(duì)照相比，各處理的水體CODCr去除率分別為地衣芽孢桿菌70.6%、嗜麥芽寡養(yǎng)（窄食）單胞菌58.5%、短小芽孢桿菌48.5%（圖2）。地衣芽孢桿菌和嗜麥芽寡養(yǎng)（窄食）單胞菌表現(xiàn)了明顯的水體CODCr清除能力。

2.4.2 不同菌株對(duì)河水氨氮（NH3-N）的去除作用 不同菌株處理水體NH3-N含量變化趨勢(shì)不同。各菌株對(duì)水體NH3-N均有去除作用。與對(duì)照相比，去除率分別為地衣芽孢桿菌84.8%、嗜麥芽寡養(yǎng)（窄食）單胞菌52.3%、短小芽孢桿菌39.4%（圖3）。地衣芽孢桿菌和嗜麥芽寡養(yǎng)（窄食）單胞菌表現(xiàn)了較強(qiáng)的降低水體氨氮的能力。

濟(jì)南小清河水樣中分離鑒定的13株細(xì)菌微生物分屬于8個(gè)屬，分別為腸桿菌屬（Enterobacter）、氣單胞菌屬（Aeromonas）、克雷伯氏菌屬 （Klebsiella）、微桿菌屬（Microbacterium）、希瓦氏菌屬（Shewanella）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、枸櫞酸桿菌屬（Citrobacter）和寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas），表明小清河細(xì)菌微生物種群的多樣性。這些細(xì)菌中既有常見(jiàn)菌，如各類(lèi)氣單胞菌和微桿菌等，也有條件致病菌如希瓦氏菌、弗氏枸櫞酸桿菌和嗜麥芽寡養(yǎng)（窄食）單胞菌，特別是存在對(duì)人和動(dòng)物健康有嚴(yán)重威脅的致病菌如克雷伯氏菌、金黃桿菌，因此在修復(fù)水環(huán)境、凈化水質(zhì)的同時(shí)，要進(jìn)一步考慮對(duì)有害致病菌的防控。

本試驗(yàn)還研究了從河水中分離鑒定的地衣芽孢桿菌QH11、短小芽孢桿菌QH09和嗜麥芽寡養(yǎng)（窄食）單胞菌QH13對(duì)水污染重要指標(biāo)CODCr和氨氮含量的去除能力。結(jié)果表明，地衣芽孢桿菌對(duì)CODCr和NH3-N的去除率分別為70.6%和84.8%，嗜麥芽寡養(yǎng)（窄食）單胞菌的去除率分別為58.5%和52.3%，短小芽孢桿菌的去除率分別為48.5%和39.4%。地衣芽孢桿菌QH11和嗜麥芽寡養(yǎng)（窄食）單胞菌QH13均表現(xiàn)出較強(qiáng)的去除污染水體CODCr和NH3-N的能力，對(duì)水體污染修復(fù)具有開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。芽孢桿菌是一類(lèi)重要的益生菌資源，具有降解工業(yè)廢水和有機(jī)污染物的作用[12～15]，關(guān)于芽孢桿菌對(duì)城市河水污染修復(fù)的報(bào)道較少。本研究表明，分離自小清河水中的地衣芽孢桿菌具有很強(qiáng)的去除污染水體CODCr和氨氮去除率的能力，短小芽孢桿菌對(duì)水質(zhì)改良也具有一定作用。嗜麥芽寡養(yǎng)（窄食）單胞菌屬條件致病菌，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)有些菌株具有特異性降解羽毛等角蛋白質(zhì)能力[16～18]和對(duì)水中重金屬污染的吸附與去除能力[19]。本研究首次發(fā)現(xiàn)嗜麥芽寡養(yǎng)（窄食）單胞菌對(duì)水體CODCr和氨氮具有明顯的去除作用。今后將繼續(xù)開(kāi)展地衣芽孢桿菌QH11和嗜麥芽寡養(yǎng)（窄食）單胞菌QH13對(duì)水質(zhì)修復(fù)的作用機(jī)制研究，為利用微生物技術(shù)修復(fù)河水污染提供理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)：

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